課題一：RNAi抑制USP18的表達對IFNα抗HBV效應的體外研究課題二：干擾素刺激基因的特異性染色預測慢性乙型肝炎α干擾素療效的初步研究.pdf

1、本研究分為二部分：
　　課題一：RNAi抑制USP18的表達對IFNα抗HBV效應的體外研究
　　乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）感染是所有國家公共的衛(wèi)生問題，已有2億多人被影響。雖然從1982年就有高效的乙肝病毒疫苗，可是仍有4.0多億慢性攜帶者，而且其中75％的攜帶者在亞洲太平洋地區(qū)。慢性HBV感染導致的肝炎后肝硬化和肝細胞性肝癌（hepatocellular carcinoma,HCC）等終末

2、期肝病，目前已成為危害中國人民生命健康的主要疾病。近些年來雖然有新型抗HBV藥物不斷出現(xiàn)，但是其療效不盡如人意，仍然需要探索新型的抗HBV的治療方法。α干擾素是抗HBV藥物之一，然而有相當部分病人無應答。這些無應答的患者中α干擾素不敏感的機制是難以捉摸的。在前期研究中我們發(fā)現(xiàn)預測慢性乙型肝炎患者α干擾素治療前的肝組織中一些干擾素刺激基因的表達增加與α干擾素治療無應答組有關。因此，深入了解RNAi抑制泛素特異性肽酶（ubiquitin s

3、pecific peptidase18，USP18）的表達以及調控具有重要的意義。
　　目的：應用RNA干擾技術構建重組USP18 RNAi慢病毒載體，并且篩選出最有顯著抑制USP18表達的重組RNAi慢病毒載體；然后轉染 HepG2.2.15細胞后觀察 HBV DNA及干擾素敏感基因15（IFN-sensitive gene，ISG15）的表達。
　　方法：在本研究中，我們在體外化學合成針對USP18基因的三個靶點siRN

4、A序列（siRNA1,siRNA2,siRNA3），以慢病毒載體介導下構建重組USP18 RNAi慢病毒載體，轉染HepG2.2.15細胞5天后，實時熒光定量PCR（real-time PCR）檢測USP18 mRNA的表達水平，從中篩選抑制率最高的重組USP18 RNAi慢病毒載體；然后再轉染HepG2.2.15細胞時加入長效聚乙二醇干擾素（Pegylated interferon alfa-2a，PEG-IFNα），分五組，A組和B

5、組為重組 siRNA慢病毒載體轉染組，C組和D組為未轉染組，E組為空白組；其中，A組和C組培養(yǎng)于含有PEG-IFNα、含10%胎牛血清的MEM培養(yǎng)液中， B組和D組培養(yǎng)于含10%胎牛血清的MEM培養(yǎng)液中。即A組為PEG-IFNα+USP18-RNAi-LV1＃， B組為USP18-RNAi-LV1＃， C組為 PEG-IFNα+NC-GFP-LV， D組為NC-GFP-LV，E組為空白組），在8小時、3天、7天后三個時間點收集HepG2

6、.2.15細胞的上清液檢測HBV DNA的復制，并在感染后3天收集HepG2.2.15細胞的蛋白用Western blot檢測ISG15蛋白的表達。
　　結果：我們成功地構建了重組USP18 RNAi慢病毒載體（即USP18-RNAi-LV1＃，USP18-RNAi-LV2＃，USP18-RNAi-LV3＃）。在重組USP18 RNAi慢病毒載體轉染HepG2.2.15細胞5天后，real-time PCR結果表明：所設計的siR

7、NA1,siRNA2,siRNA3組重組慢病毒載體與對照組（陰性組：NC-GFP-LV，空白組）相比均有不同程度地抑制USP18 mRNA的表達，且成功篩選出最有效地抑制USP18表達的重組慢病毒載體USP18-RNAi-LV1＃﹙P＜0.05﹚。然后重組慢病毒載體USP18-RNAi-LV1＃轉染HepG2.2.15細胞后，隨著時間的推移，對HBV的復制抑制作用越來越顯著，尤其A組。而Western blot結果提示A組的ISG15蛋

8、白表達增加，進一步證實了上述結果,在蛋白水平得到了進一步驗證抑制USP18的表達能增強α干擾素抗病毒的活性，具有一定的臨床意義。
　　結論：通過上述實驗成功構建了USP18 RNAi重組慢病毒載體，通過抑制USP18的表達增強α干擾素的抗病毒作用，為慢性乙型肝炎患者的治療帶來新的希望。相信隨著該領域研究的不斷深入，應用RNA干擾技術沉默USP18的表達在抗HBV方面有較大的臨床應用前景。
　　課題二：干擾素刺激基因的特異性染

9、色預測慢性乙型肝炎α干擾素療效的初步研究
　　α干擾素是目前抗乙型肝炎病毒公認的主要藥物之一，但是只有部分患者有效。這些無效的患者中α干擾素不敏感的機制是難以捉摸的。在前期我們研究中發(fā)現(xiàn)預測慢性乙型肝炎患者α干擾素治療前的肝組織中一些干擾素刺激基因的表達增加與治療無效組相關。
　　目的：我們研究慢性乙型肝炎患者α干擾素治療前的肝組織中和正常肝組織中干擾素刺激基因ISG15和MxA的細胞特異性染色，擬從蛋白水平預測慢乙肝患者I

10、FN-α的療效。
　　方法：我們采用免疫組化技術檢測慢性乙型肝炎患者α干擾素治療前的肝組織中和正常肝組織中干擾素刺激基因 ISG15和 MxA的表達，其表達形式與治療療效有關。
　　結果：慢乙肝患者IFN-α治療前肝組織中有效組ISG15和 MxA蛋白的染色主要集中MACROPHAGE內，而無效組主要集中在肝細胞內。在正常的肝組織中 ISG15和 MxA偶有在肝細胞中表達。
　　結論：ISG15和 MxA在慢乙肝患者