聚乙二醇化干擾素α-2a與干擾素α-2a在體內(nèi)和體外的抗乙型肝炎病毒活性研究.pdf

1、乙型肝炎病毒屬嗜肝DNA病毒科，具有嚴(yán)格的種屬和組織特異性，它只傳染人和類(lèi)人猿等靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物，或者是這些動(dòng)物的原代培養(yǎng)肝細(xì)胞。病毒與靶細(xì)胞受體結(jié)合進(jìn)入體內(nèi)，在肝細(xì)胞特異性細(xì)胞因子作用啟動(dòng)病毒復(fù)制。 1．重組腺病毒的生物學(xué)特征的鑒定利用所構(gòu)建的具復(fù)制能力的HBV重組腺病毒傳染體外培養(yǎng)肝細(xì)胞，觀察HBV的表達(dá)情況，從而初步了解該重組HBV腺病毒的生物學(xué)特性。 重組腺病毒傳染細(xì)胞后，連續(xù)七天在細(xì)胞內(nèi)均可檢測(cè)到腺病毒載體，證明了重

2、組腺病毒對(duì)細(xì)胞的易感性和高效的基因轉(zhuǎn)移能力。重組腺病毒傳染細(xì)胞后第三天可以在培養(yǎng)上清中檢測(cè)到腺病毒基因，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，培養(yǎng)上清中腺病毒含量增加。可能是隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞增殖到一定程度后開(kāi)始老化、死亡、脫落，從而使部分重組腺病毒釋放進(jìn)培養(yǎng)上清中。 2．重組腺病毒傳染L02細(xì)胞后HBV復(fù)制的動(dòng)態(tài)分析將重組腺病毒介導(dǎo)的具自行復(fù)制能力的HBV傳染人正常肝細(xì)胞株L02，獲得能表達(dá)HBV標(biāo)志物的細(xì)胞模型，應(yīng)用酶聯(lián)免疫技術(shù)動(dòng)態(tài)觀察

3、L02細(xì)胞內(nèi)HBsAg和HBeAg的表達(dá)；HBV熒光定量PCR檢測(cè)培養(yǎng)上清中HBV DNA載量； 以不含蛋白酶的裂解液裂解細(xì)胞，利用cccDNA和rcDNA與蛋白質(zhì)結(jié)合能力的差異提取cccDNA，并以綠豆核酸酶消化殘留的rcDNA；利用cccDNA和rcDNA結(jié)構(gòu)上的差異，設(shè)計(jì)跨越負(fù)鏈缺口的引物，并通過(guò)熒光定量PCR檢測(cè)cccDNA，探討重組腺病毒傳染L02細(xì)胞后細(xì)胞內(nèi)cccDNA的變化。 以病毒含量分別為10<'7>、

4、10<'6>拷貝/ml的乙型肝炎患者血清進(jìn)行引物的特異性檢測(cè)，結(jié)果均為陰性，證明引物對(duì)HBV cccDNA具有特異性。 質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品倍比稀釋為10<'2>，10<'3>，10<'4>，10<'5>，10<'6>，10<'7>拷貝/ml進(jìn)行引物的敏感性檢測(cè)，質(zhì)粒在10<'3>-10<'7>范圍內(nèi)均能檢測(cè)到信號(hào)，因此，該方法的敏感性可以達(dá)到10<'3>拷貝/ml。 以該特異性引物進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)重組腺病毒傳染后L02細(xì)胞

5、后細(xì)胞內(nèi)cccDNA的量，cccDNA在傳染后一天即可在細(xì)胞內(nèi)檢測(cè)到，第四天達(dá)到高峰，隨后呈下降趨勢(shì)，但仍維持相對(duì)穩(wěn)定狀態(tài)。認(rèn)為cccDNA的穩(wěn)定維持在一定水平，既能滿足病毒復(fù)制的需要，又不會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性，有利于維持病毒對(duì)細(xì)胞的長(zhǎng)期傳染狀態(tài)。 HBV熒光定量PCR檢測(cè)培養(yǎng)上清中HBV DNA，培養(yǎng)上清中HBV DNA含量在病毒傳染細(xì)胞后第五天達(dá)到最高，隨后維持穩(wěn)定狀態(tài)。 ELISA檢測(cè)培養(yǎng)上清中HBsAg和HBeAg的

6、分泌，HBsAg和HBeAg的表達(dá)量隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，第六天達(dá)到高峰，隨后呈下降趨勢(shì)。一是由于細(xì)胞生長(zhǎng)已到達(dá)平臺(tái)期，細(xì)胞內(nèi)已建立一種穩(wěn)定的病毒傳染狀態(tài)；二是隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，培養(yǎng)的細(xì)胞幾乎停止分裂生長(zhǎng)，細(xì)胞合成代謝功能降低，出現(xiàn)老化現(xiàn)象，因此完全依賴于細(xì)胞功能才能進(jìn)行復(fù)制和表達(dá)的病毒，其復(fù)制水平也會(huì)隨之下降。對(duì)。HBV cccDNA、HBV DNA、HBsAg和HBeAg進(jìn)行Spearman相關(guān)性分析，培養(yǎng)上清中HBV DNA的量與

7、HBsAg和HBeAg的分泌量之間存在正相關(guān)關(guān)系，分別為：r<,s>=0.881，P=0.004(雙側(cè))；r<,s>=0.857,P=0.007(雙側(cè))，從而認(rèn)為HBV蛋白表達(dá)規(guī)律與培養(yǎng)上清中HBV DNA相關(guān)，而細(xì)胞內(nèi)HBV cccDNA與培養(yǎng)上清中HBV DNA的量及HBsAg和HBeAg的分泌量之間無(wú)明顯相關(guān)性(P>0.05)。 3．IFNa-2a與Peg-IFNa-2a在體外對(duì)HBV復(fù)制的影響以重組腺病毒傳染的L02細(xì)胞

8、為細(xì)胞模型，通過(guò)觀察IFNa-2a與Peg-IFNa-2a處理前后培養(yǎng)上清HBV DNA、細(xì)胞內(nèi)HBV cccDNA、HBsAg與HBeAg的變化，比較。IFNa-2a與Peg-IFNa-2a的體外抗病毒作用，并觀察該兩種干擾素對(duì)乙型肝炎病毒復(fù)制的第一個(gè)環(huán)節(jié)有無(wú)抑制作用。 以MTT法進(jìn)行細(xì)胞毒性檢測(cè)，在本實(shí)驗(yàn)濃度下，IFNa-2a與Peg-IFNa-2a對(duì)腺病毒傳染的L02細(xì)胞均無(wú)細(xì)胞毒性作用(P>0.05)。 結(jié)果顯示

9、，Peg-IFNa-2a藥物組中，三個(gè)藥物濃度組處理的細(xì)胞中HBsAg及HBeAg與對(duì)照組比較，均無(wú)顯著性差異(P>0.05)。IFNa-2a藥物組中，劑量為100 IU/ml組的細(xì)胞分泌的HBsAg及HBeAg與對(duì)照組比較，無(wú)顯著性差異(P>0.05)；劑量為500 IU/ml組及1000 IU/ml組的細(xì)胞分泌的HBsAg及HBeAg與對(duì)照組相比顯著減少(P<0.05，P<0.001)，認(rèn)為IFNa-2a在劑量為500 IU/ml以

10、上時(shí)對(duì)重組腺病毒傳染的L02細(xì)胞的HBV抗原分泌有抑制作用。 HBV熒光定量PCR檢測(cè)培養(yǎng)上清中HBV DNA及應(yīng)用HBV cccDNA特異性引物進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)cccDNA含量。Peg-IFNa-2a藥物組中，三個(gè)藥物濃度組處理的細(xì)胞培養(yǎng)上清中HBV DNA含量與對(duì)照組比較，均無(wú)顯著性差異(P>0.05)。IFNa-2a藥物組中，劑量為100 IU/ml組的細(xì)胞培養(yǎng)上清中HBV DNA含量與對(duì)照組比較，無(wú)顯著性差異

11、(p>0.05)；劑量為500 IU/ml組及1000 IU/ml組的細(xì)胞培養(yǎng)上清中HBV DNA含量與對(duì)照組相比顯著減少(P<0.05)，認(rèn)為IFNa-2a在劑量為500 IU/ml以上時(shí)對(duì)重組腺病毒傳染的L02細(xì)胞內(nèi)HBV DNA的合成有抑制作用。比較各組細(xì)胞內(nèi)HBV cccDNA，各藥物組細(xì)胞與對(duì)照組細(xì)胞的cccDNA含量均無(wú)顯著性差異(p>0.05)，認(rèn)為短期的藥物處理不能抑制細(xì)胞內(nèi)cccDNA的合成。 4．IFNa-2

12、a與Peg-IFNa-2a在體內(nèi)對(duì)HBV復(fù)制的影響利用重組腺病毒傳染小鼠，使HBV基因在小鼠體內(nèi)表達(dá)，構(gòu)建HBV傳染的小鼠模型，利用該模型研究IFNa-2a和Peg-IFNa-2a的體內(nèi)抗病毒作用，并觀察IFNa-2a與Peg-IFNa-2a對(duì)小鼠體內(nèi)HBV cccDNA的清除是否存在差異。 重組腺病毒以尾靜脈注射的方法接種4周齡的昆明小鼠，接種劑量為2×10<'9>pfu，建立HBV傳染的動(dòng)物模型。分別以IFNa-2a與Peg

13、-IFNa-2a對(duì)小鼠進(jìn)行皮下注射，參照人體臨床用藥，IFN α-2a用藥劑量為1.7×10<'3>IU/只，三次/周；Peg-IFNa-2a用藥劑量為0.06μg/只，一次/周；以生理鹽水為對(duì)照組，一次/周。分別于第4周和第8周觀察腺病毒介導(dǎo)的HBV在小鼠體內(nèi)的復(fù)制情況及藥物對(duì)HBV在體內(nèi)復(fù)制的影響。提取兩個(gè)藥物組和對(duì)照組傳染小鼠血清DNA及肝臟DNA，以HBV特異性引物進(jìn)行PCR檢測(cè)，傳染小鼠血清及肝臟中結(jié)果均為陽(yáng)性。 以腺

14、病毒特異引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，檢測(cè)傳染小鼠血清及肝臟中的腺病毒基因組。第4周時(shí)三組傳染小鼠肝臟中均可檢出腺病毒DNA，第8周時(shí)再次檢測(cè)傳染小鼠肝臟中腺病毒DNA，結(jié)果均為陰性；而三組傳染小鼠血清中一直不能檢測(cè)出腺病毒DNA。結(jié)果表明，小鼠血清中不含重組腺病毒，血清中的HBVDNA是由于病毒在體內(nèi)復(fù)制而產(chǎn)生的子代病毒。 采用ELISA法檢測(cè)了小鼠血清中IFN-丫含量，各實(shí)驗(yàn)組間IFN-丫含量比較有顯著性差異(P<0.001)，但不同

15、時(shí)間(第4周和第8周)各組IFN-丫含量比較無(wú)顯著性差異(P>0.05)。各實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行兩兩比較，結(jié)果表明，Peg-IFNa-2a組和IFNa-2a組與對(duì)照組比較均有顯著性差異(P<0.05)；比較兩個(gè)藥物組之間所誘生的IFN-丫的含量，Peg-IFNa-2a組高于IFNa-2a組(P<0.05)。認(rèn)為Peg-IFNa-2a與IFNa-2a在體內(nèi)均具有免疫調(diào)節(jié)能力，但Peg-IFNa-2a的免疫調(diào)節(jié)作用強(qiáng)于IFNa-2a。 熒光定

16、量PCR檢測(cè)小鼠血清HBV DNA，比較各實(shí)驗(yàn)組小鼠血清中的病毒含量變化，結(jié)果顯示，兩個(gè)藥物組與對(duì)照組比較均有顯著性差異(P<0.05)，表明兩個(gè)藥物對(duì)小鼠血清中病毒均有抑制作用。兩個(gè)藥物組之間比較無(wú)顯著性差異(P>0.05)；各實(shí)驗(yàn)組中血清病毒載量在第4周與第8周的差異無(wú)顯著性(P>0.05)，從而認(rèn)為Peg-IFNa-2a與IFNa-2a在本實(shí)驗(yàn)時(shí)間范圍內(nèi)對(duì)小鼠血清中病毒的作用無(wú)差異。傳染小鼠肝臟DNA以綠豆核酸酶處理，以HBV c

17、ccDNA特異性引物進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)傳染小鼠肝臟中HBV cccDNA含量。結(jié)果顯示，第4周與第8周時(shí)三組傳染小鼠肝臟中HBV cccDNA含量均無(wú)顯著性差異(P>0.05)。從而認(rèn)為IFNa-2a與Peg-IFNa-2a雖然能抑制血清中的病毒復(fù)制，但對(duì)肝臟內(nèi)HBVcccDNA的影響不顯著。 結(jié)論：建立復(fù)制型HBV重組腺病毒的體外傳染和體內(nèi)傳染模型。重組腺病毒在體外培養(yǎng)細(xì)胞中可以表達(dá)HBV、HBsAg和HBeAg，并可檢測(cè)