松墨天牛OBP基因的組織表達(dá)、蛋白結(jié)構(gòu)和原核表達(dá)研究.pdf

1、目的:
　　1.RT-qPCR檢測OBPs在松墨天牛不同組織不同發(fā)育階段的表達(dá)水平，得到組織表達(dá)譜用于推斷OBP基因在松墨天牛生命周期中發(fā)揮的表達(dá)調(diào)控功能。
　　2.通過對MaltOBP2和MaltOBP6的序列分析，并預(yù)測其蛋白結(jié)構(gòu)，為后續(xù)解析MaltOBP2和MaltOBP6的功能特性提供基礎(chǔ)。
　　3.對MaltOBP2和MaltOBP6基因進(jìn)行原核表達(dá)載體的構(gòu)建和蛋白表達(dá)研究，為進(jìn)一步研究配體結(jié)合能力和結(jié)合機(jī)制

2、奠定基礎(chǔ)。
　　方法:
　　1.松墨天牛OBP基因的組織和發(fā)育表達(dá)譜研究
　　提取松墨天牛3日齡雄蟲的頭、觸角、下顎須、腹部末端、足;5齡幼蟲的觸角和下顎須;3日齡雌成蟲和雌蛹觸角的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄cDNA，并設(shè)計(jì)用于RT-qPCR檢測OBP的引物，對qPCR結(jié)果進(jìn)行顯著性分析。
　　2.松墨天牛MaltOBP2、MaltOBP6基因的序列分析
　　利用BLAST功能將前期轉(zhuǎn)錄組測序得到的基因序列與NCBI

3、庫中的基因序列進(jìn)行比對，確定MaltOBP2和MaltOBP6的ORF區(qū)域，利用軟件Lasergene對MaltOBP2和MaltOBP6基因編碼的氨基酸序列進(jìn)行預(yù)測，并利用軟件Clustal對得到的氨基酸序列進(jìn)行比對，使用Mega5.1軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建。利用在線軟件SignalP對MaltOBP2和MaltOBP6氨基酸序列中的信號肽進(jìn)行預(yù)測。將去除信號肽的氨基酸序列導(dǎo)入在線軟件I-TASSER進(jìn)行二級結(jié)構(gòu)、三級結(jié)構(gòu)和配體結(jié)合

4、位點(diǎn)預(yù)測。
　　3.松墨天牛MaltOBP2、MaltOBP6基因的克隆與原核表達(dá)研究
　　(1)根據(jù)MaltOBP2和MaltOBP6的ORF全序列，設(shè)計(jì)帶酶切位點(diǎn)的全序列擴(kuò)增引物，PCR產(chǎn)物與載體pET-32a(+)相連接，表達(dá)于BL21(DE3) pLysS菌株。
　　(2)重組質(zhì)粒按比例接種至新鮮LB培養(yǎng)基，待菌液OD600達(dá)到0.6左右時，選擇優(yōu)化合適的溫度、轉(zhuǎn)速、IPTG濃度和誘導(dǎo)時長等條件來大量誘導(dǎo)表達(dá)融

5、合蛋白。
　　(3)表達(dá)菌液經(jīng)壓力破碎后亞超速離心收集上清蛋白，利用SDS-PAGE和Western Blot鑒定結(jié)果，并對融合蛋白進(jìn)行了后續(xù)的蛋白純化和腸激酶切去除His標(biāo)簽蛋白實(shí)驗(yàn)。
　　結(jié)果:
　　1.組織和發(fā)育表達(dá)譜結(jié)果:松墨天牛大部分OBP基因在幼蟲下顎須的表達(dá)量都顯著大于幼蟲觸角，但下顎須的表達(dá)量隨著發(fā)育階段的變化而變化，有的在成蟲階段增強(qiáng)，有的減弱甚至消失。而OBPs基因，除了MaltOBP26在雄蟲觸角

6、基本檢測不到外，其他基因在雄蟲觸角表達(dá)量顯著比幼蟲觸角更高。另外，大部分OBPs在雄性松墨天牛觸角的表達(dá)量比雌蟲觸角顯著要高。MaltOBP2和MaltOBP6在成蟲頭部的表達(dá)量都顯著高于其他組織，MaltOBP6的觸角表達(dá)量顯著低于其他組織。MaltOBP2在蛹期觸角的表達(dá)量最高，在成蟲觸角的表達(dá)量最低，而MaltOBP6卻在幼蟲觸角的表達(dá)量最高。
　　2.序列分析結(jié)果:得到兩個松墨天牛氣味結(jié)合蛋白基因MaltOBP2（Genb

7、ank登錄號:KP120891）和MaltOBP6（Genbank登錄號:KP120892），ORF長度分別為402 bp和408 bp，翻譯的氨基酸序列均含有4個保守的半胱氨酸位點(diǎn)，表明得到的兩個OBP均屬于Minus-C OBP蛋白亞家族，成熟MaltOBP2和MaltOBP6蛋白的分子量大小分別為13.04 kDa和13.36kDa，且具有分泌蛋白的特征，都是疏水性蛋白，但是推測得到兩個OBP蛋白的配體結(jié)合位點(diǎn)和極性卻完全不同。通

8、過參數(shù)可知兩個OBP蛋白預(yù)測的模型已接近實(shí)際構(gòu)型。
　　3.原核表達(dá)結(jié)果:本文成功構(gòu)建了MaltOBP2和MaltOBP6的pET32a(+)高表達(dá)原核表達(dá)載體，并進(jìn)行了OBP蛋白誘導(dǎo)表達(dá)，低溫（16℃和20℃）條件利于融合蛋白表達(dá)在上清液中，延長誘導(dǎo)表達(dá)時間(12h)可以增加蛋白的表達(dá)量。Western Blot免疫印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示條帶單一清晰，表明重組載體上的His標(biāo)簽特異性結(jié)合效果好。蛋白純化后SDS-PAGE結(jié)果顯示，得到

9、的融合蛋白純度較好，腸激酶切后的SDS-PAGE結(jié)果顯示去His標(biāo)簽后的目的蛋白符合預(yù)期大小，具備后續(xù)實(shí)驗(yàn)條件。
　　結(jié)論:
　　1.通過RT-qPCR檢測松墨天牛OBPs在不同組織不同發(fā)育階段的相對表達(dá)水平，可以看出下唇須相比于頭部在幼蟲時期表現(xiàn)的更為突出，說明下唇須對于幼蟲來說具有重要的作用，可能涉及到取食和寄主植物的定位功能。雄蟲下唇須經(jīng)過幼蟲期的發(fā)育后，很多OBPs的轉(zhuǎn)錄表達(dá)得到了進(jìn)一步的增強(qiáng)。大部分成蟲觸角的OBP

10、s表達(dá)量比幼蟲觸角顯著性提高，說明觸角對氣味物質(zhì)的識別在成蟲后才開始發(fā)揮一定的功能。另外，從雌雄成蟲觸角的相對表達(dá)量比較可知，大部分雄蟲觸角的OBPs表達(dá)量要顯著大于雌蟲，推測很多OBP還涉及性信息素氣味信號的識別和結(jié)合功能。通過發(fā)育表達(dá)譜結(jié)果分析，發(fā)現(xiàn)MaltOBP2和MaltOBP6在幼蟲、蛹和成蟲3個階段都有表達(dá)，尤其MaltOBP2在幼蟲和蛹表達(dá)量很高，說明MaltOBP2可能參與到松墨天牛幼蟲的整個發(fā)育階段，并以某種機(jī)制參與寄

11、主識別和取食過程。由此可見，屬于Minus-C OBP亞家族的MaltOBP2和MaltOBP6不同于常規(guī)OBPs在觸角的高表達(dá)現(xiàn)象，意味著其功能可能不僅僅局限于嗅覺，而會涉及更廣泛的生理機(jī)制。
　　2.本實(shí)驗(yàn)主要選取了從松墨天?？寺〉膬蓚€Minus-C OBP家族基因MaltOBP2和MaltOBP6進(jìn)行了進(jìn)一步的深化研究，其中MaltOBP6是首次被報道的松墨天牛Minus-C OBP。我們通過蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測，發(fā)現(xiàn)MaltOBP

12、2和MaltOBP6的6個α螺旋區(qū)域相似，N端包含16個氨基酸的信號肽，但配體結(jié)合位點(diǎn)和氨基酸種類及極性卻大不相同，這可能與配體結(jié)合腔對外界氣味分子的選擇性結(jié)合特性以及pH值相關(guān)的配體結(jié)合和釋放機(jī)制有重要關(guān)系。
　　3.重組表達(dá)質(zhì)粒pET32a-MaltOBP2/MaltOBP6，在常規(guī)方法誘導(dǎo)表達(dá)時，大部分集中在包涵體中，為了能得到上清融合蛋白的表達(dá)，經(jīng)過對IPTG濃度、誘導(dǎo)時間、誘導(dǎo)溫度、轉(zhuǎn)速等方面的反復(fù)試驗(yàn)后，發(fā)現(xiàn)IPTG終

13、濃度和轉(zhuǎn)速對蛋白表達(dá)量影響較少，但考慮到IPTG對菌體的抑制生長作用，高轉(zhuǎn)速會產(chǎn)生的較多泡沫，故實(shí)驗(yàn)中選擇了低濃度和低轉(zhuǎn)速。誘導(dǎo)溫度是蛋白表達(dá)的重要因素，兩個OBP的誘導(dǎo)溫度有差異，MaltOBP2在20℃可溶性表達(dá)量較高，MaltOBP6在16℃下可溶性表達(dá)量最高，此處也說明兩個OBP存在結(jié)構(gòu)性質(zhì)上的差異，誘導(dǎo)時長與表達(dá)量呈正比關(guān)系，故選取12h以獲得最大的得率。
　　4.基于以上結(jié)果，后續(xù)需解析MaltOBP2和MaltOBP