前列腺癌miR-23b的表達與調控機制的初步研究.pdf

1、背景：
　　 前列腺癌是男性泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，嚴重威脅著人類的身體健康。我國是世界上最大的發(fā)展中國家，隨著老年人口的增多、飲食結構的改變及腫瘤診斷技術的提高，前列腺癌發(fā)病率日趨上升，如何治療前列腺癌顯得極為迫切和重要。
　　 直腸指檢、影像學與組織檢查是前列腺癌診斷的主要方法，前列腺的組織形態(tài)與生物學行為復雜，這些檢查對早期診斷前列腺癌比較困難。分子生物學方法證明多種抑癌基因和癌基因的共同作用導致前列腺癌發(fā)生與發(fā)

2、展，目前從蛋白與基因水平可以實現前列腺癌檢測，使用免疫組化、RT-PCR與芯片等方法以分析和比較PCa細胞、正常細胞和組織基因產物，目前蛋白組學的表達研究已鑒定出一系列用于PCa診斷與提供預后評估的生物標記。前列腺特異抗原(PSA)已經成為前列腺癌腫瘤標志物廣泛在臨床應用，但其存在特異與敏感的有限性，使其在臨床仍存在爭議。
　　 前列腺特異抗原(PSA)是當前前列腺增生與前列腺癌臨床診斷的主要鑒別與診斷手段，前列腺癌的病理分級應

3、用Gleason評分來評定，腫瘤惡性程度以評測前列腺癌細胞的惡性分級，TNM分期用來進行前列腺癌的臨床分期。前列腺炎、前列腺增生、乳腺癌等疾病都會引起血漿PSA升高。PSA值為4～10ng/ml時，區(qū)別BPH與PCa困難。Gleason評分易受病理醫(yī)生經驗與主觀看法的影響，對前列腺癌的惡性程度客觀準確判定困難。臨床需要比PSA更加可靠的指標，需要比Gleason評分和腫瘤惡性程度的分級更客觀的病理分級指標。當前的前列腺癌治療方式仍以手術

4、與術后輔助放療和化療為主，但其治療效果仍不夠理想，影響生存率與致死的主要原因是前列腺癌的復發(fā)和轉移（特別是骨轉移）。
　　 microRNA(miRNA)是一組保守的、非編碼的、長約22nt的非編碼單鏈RNA分子，分布在病毒、植物至高等哺乳動物等生物之中。目前，miRNA的已知功能是在轉錄后水平調控基因表達，microRNA主要作為基因表達的負調控因子，通過抑制靶基因翻譯以起到調控作用。許多研究顯示，miRNA在細胞的分化、增殖

5、、凋亡、個體發(fā)育以及腫瘤的發(fā)生與發(fā)展等方面有重要作用。microRNA為前列腺癌的診斷、治療和預后評估提供了新的工具。研究表明microRNAs不但調控腫瘤細胞的增殖凋亡，還參與調控腫瘤的細胞轉移。有相當數量的microRNAs經研究證實參與調控腫瘤細胞轉移的分子機制，如miR-10b、miR-21、miR-335、miR-373與miR-520c等參與調控乳腺癌細胞的轉移機制;miR-21與miR-224參與調控前列腺癌細胞的轉移;m

6、iR-21也可以促進結腸癌細胞的轉移;miR-7、miR-10a、miR-125b、miR-222和miR-452等參與調控膀胱上皮癌的轉移機制。miRNAs發(fā)揮調控作用是一種miRNA可以調控多個靶基因，一個靶基因可以被多個miRNAs所調控，其調控方式可以通過對其靶基因mRNA的轉錄后表達調節(jié)。當miRNA與其靶向mRNA完全或幾乎完全互補時，可引起目的mRNA被降解，當miRNA與靶向mRNA是不完全互補時，則是負調控翻譯過程，阻

7、礙蛋白質的翻譯。研究表明，腫瘤組織的miRNAs表達譜與腫瘤的類型相關，不同種類的腫瘤具有不同的miRNAs表達譜，因此miRNA可作為腫瘤診斷標志物，而且可用于腫瘤的治療和預后判斷。
　　 惡性腫瘤細胞的糖酵解途徑越來越受到重視，惡性腫瘤細胞的糖酵解途徑產能明顯低于線粒體的氧化磷酸化，但惡性腫瘤細胞可以從活躍的糖酵解代謝中受益，這利于腫瘤細胞的生長，有重要的病理生理意義。針對腫瘤代謝路徑的深入研究為惡性腫瘤的靶向治療提供了極具

8、潛在價值的研究方向。
　　 MiR-23b是一個參與調節(jié)多個信號通路的多功能miRNA，作用涉及分化、增殖、凋亡、細胞粘附等多個方面，而且關于其功能及作用機制的研究仍在不斷擴展。
　　 MiR-23b是靶向谷氨酰胺酶的基因，靶蛋白是線粒體的谷氨酰胺酶，其是三竣酸循環(huán)生成ATP的關鍵酶之一。抑制miR-23b可以間接提高谷氨酰胺酶基因mRNA的翻譯，產生大量的目標蛋白為線粒體的谷氨酰胺酶，該酶催化谷氨酰胺分解成為谷氨酸，通

9、過三竣酸循環(huán)生成ATP來滿足腫瘤細胞的能量需求。miR-23b證實在腫瘤細胞的能量代謝中有著重要作用。
　　 PRDX蛋白質是細胞抗氧化防御的重要調節(jié)因子，被證實參與惡變和治療抵抗。多功能PRDXs被證明與前列腺癌相關，研究表明前列腺癌的細胞株中有共同表達的蛋白水平的PRDXs。穩(wěn)定反義轉染允許部分選擇性抑制PRDX1、2或3而不是部分抑制4時，前列腺癌細胞對過氧化氫或有機過氧化物變得更加敏感。升高表達的PRDX1提高雄激素受體

10、(AR)的轉錄，在PCa刺激缺氧/復氧配體、受體的敏感性方面發(fā)揮了重要作用，因此為前列腺癌細胞在不利的微環(huán)境中提供生存優(yōu)勢。PRDX1一直被視為是在阻止雄激素依賴性前列腺癌轉化為雄激素難治型的治療目標。此外，在前列腺癌中，PRDX3和PRDX4也是差異表達，PRDX3蛋白在前列腺癌比相鄰的良性前列腺組織上調。
　　 PRDX3是唯一定位在線粒體內的PRDX家族成員，主要作用為抗氧化、保持細胞內活性氧(ROS)的穩(wěn)態(tài)。線粒體是多數

11、真核細胞產生ROS的主要部位，ROS在細胞增殖、分化與凋亡等重要細胞活動的調控中發(fā)揮著重要作用。正常數量ROS在細胞的生理活動中有重要的作用，而過多的ROS能攻擊細胞內的大分子，產生DNA損傷、蛋白質氧化和脂質過氧化等變化導致細胞損傷，促使致癌物質產生誘導腫瘤，但ROS同時具有殺傷癌細胞與誘導細胞凋亡能力，推測細胞的氧化還原狀態(tài)和腫瘤形成有密切關系。PRDX3是凋節(jié)細胞內ROS水平以及具有影響細胞凋亡功能的基因，同時又是c-myc癌基因

12、的靶基因。在c-myc癌基因產生促進細胞增殖和轉化的過程中必需PRDX3的參與，這也說明PRDX3可能與腫瘤的形成相關。
　　 本文通過對miR-23b在前列腺癌診斷中的表達進行進一步的分析，利用熒光定量RT-PCR技術對miR-23b在前列腺癌中的表達進行檢測，并分析其臨床意義，并就其在前列腺癌細胞能量中的作用及其機制進行初步的研究。
　　 第一章，前列腺癌中miR-23b的表達與意義
　　 目的:
　　

13、 miRNA在細胞的分化、增殖、凋亡、個體發(fā)育以及腫瘤的發(fā)生和發(fā)展等方面有重要的作用。我們的miRNA芯片檢測發(fā)現前列腺癌組織miR-23b表達下調，但由于miRNA片段過小及樣本間的差異，因此芯片雜交結果可能存在一定的假陽性，重現性與準確性比較差，一般多用于初篩，但需要Northernblot或實時定量PCR等實驗方法來驗證。本實驗運用實時熒光定量PCR技術進行驗證，并通過擴大樣本量，運用實時熒光定量PCR技術進行驗證，同時進一步探

14、討特定miR-23b表達與患者年齡、腫瘤大小、分期、淋巴結轉移方面所起的作用;并觀察其在前列腺癌有無特異性表達;
　　 方法:
　　 1.取實驗室液氮凍存的前列腺癌及配對的正常組織進行HE染色，確認病理情況后;采用Agilent人miRNA寡核苷酸基因芯片，對前列腺癌組織及配對正常組織進行檢測，篩選前列腺癌差異表達的miRNAs以及觀察miR-23b的表達。
　　 2.選擇miR-23b，在前列腺癌及配對正常組織

15、中用實時熒光定量PCR進行驗證，觀察表達狀況。
　　 3.選擇miR-23b，在前列腺癌及其配對的正常組織中用原位雜交進行驗證，并觀察其與患者年齡、腫瘤大小、PSA、Gleason評分和病理分期等的關系。
　　 結果:
　　 1.通過對液氮凍存的前列腺癌及配對正常組織的HE染色，確認病理狀況;進行miRNAs芯片檢測，發(fā)現在前列腺癌組織與配對的正常組織中表達差異的miRNAs，miR-23b在前列腺癌組織中比相鄰

16、的良性前列腺組織中明顯下調。
　　 2.通過實時熒光定量PCR檢測，發(fā)現miR-23b在前列腺癌組織中的表達水平比相鄰的良性前列腺組織降低(P＜0.01)，表達情況與芯片一致。
　　 3.對前列腺癌及配對正常組織中用原位雜交進行驗證，發(fā)現miR-23b在前列腺癌組織中的表達水平比相鄰的良性前列腺組織(P＜0.01)降低，miR-23b在轉移前列腺癌組織比非轉移前列腺癌的表達降低(P＜0.001)，miR-23b表達降低與

17、Gleason評分升高(P=0.002)和較高的病理分期(P=0.022)相關，無論是單因素和多因素分析表明，miR-23b的下調是一個提示是生化復發(fā)不良預后的獨立預測因素。
　　 結論:
　　 1.前列腺癌有其獨特的miRNA表達譜，miR-23b在前列腺癌組織中明顯下調;
　　 2.實時熒光定量PCR驗證miR-23b驗證的差異表達情況與芯片一致;
　　 3.miR-23b可能作為前列腺癌潛在的分子標

18、志物，miR-23b的下調是一個提示生化復發(fā)不良預后的獨立預測因素。
　　 第二章，miR-23b調控PRDX3研究
　　 目的:
　　 miR-23b是靶向谷氨酰胺酶基因，靶蛋白是線粒體的谷氨酰胺酶，是三竣酸循環(huán)生成ATP的關鍵酶之一。癌基因轉錄因子c-myc對microRNAs具有調控作用，通過抑制miR-23a和miR-23b的轉錄，間接地提高谷氨酰胺酶基因mRNA的翻譯，導致大量的目標蛋白線粒體谷氨酰胺酶

19、的表達，進一步催化谷氨酰胺分解為谷氨酸，通過三竣酸循環(huán)產生ATP供應腫瘤細胞的能量需求，c-Myc基因通過調控miRNA在谷氨酰胺代謝、能量與活性氧的動態(tài)平衡等之間有重要作用。過氧化物酶Ⅲ(PRDX3)在人類前列腺癌中過度表達，也是c-myc癌基因的靶基因。在c-myc癌基因表達和產生促進細胞增殖和轉化的過程中必需PRDX3的參與，說明PRDX3可能與腫瘤的形成相關。我們使用TargetScan5.1預測miR-23b的靶目標并結合差異

20、熒光凝膠蛋白組學(DIGE)結果發(fā)現在前列腺癌中符合“miRNA表達下調，其靶基因表達將上升”調節(jié)規(guī)律的靶基因PRDX3，因此我們擬進一步證明miR-23b對PRDX3的調控關系，同時研究miR-23b、PRDX3在前列腺癌中的臨床特點，及兩者參與缺氧脅迫中的作用。
　　 方法:
　　 1.通過TargetScan5.1的microRNA目標生物信息學預測系統(tǒng)，結合miRNA芯片表達數據和DIGE蛋白組學結果，篩選獲得m

21、iR-23b調節(jié)的靶基因PRDX3。
　　 2.用石蠟切片，采用免疫組化研究PRDX3前列腺癌組織中的表達，對免疫組化結果進行評分，統(tǒng)計分析PRDX3的表達與患者年齡、腫瘤大小、PSA、Gleason評分和病理分期等的關系。
　　 3.結合兩基因臨床研究結果，分析PRDX3與miR-23b兩基因的臨床相關性。
　　 4.構建miR-23b過表達載體、細胞轉染和穩(wěn)轉細胞株篩選、蛋白提取和WesternBlot檢測，

22、驗證miR-23b對PRDX3的調節(jié)功能。
　　 結果:
　　 1.PRDX3在前列腺癌組織中的表達增加。
　　 2.TargetScan5.1的microRNA目標生物信息學預測系統(tǒng)分析預測PRDX3的3個miRNAs潛在目標靶:miR-23a，miR-23b和miR-383。
　　 3.miR-23b的前列腺癌組織中的表達水平分別比相鄰的良性前列腺組織(P＜0.01)降低，而PRDX3在前列腺痛組織中