ALKBH與前列腺癌關(guān)系的初步研究.pdf

1、目的
　　近年來我國前列腺癌的發(fā)病率急速上升，已經(jīng)成為泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一。晚期前列腺癌經(jīng)過內(nèi)分泌治療后轉(zhuǎn)化為雄激素非依賴性前列腺癌之后目前尚無有效的方法治療以使患者長期生存，基因治療有可能會成為一種有前景的治療方法。ALKBH是一種DNA損傷修復(fù)蛋白，此前的研究發(fā)現(xiàn)其在前列腺癌中表達水平較高，且與腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡及侵襲相關(guān)。本實驗采用RNA沉默技術(shù)通過抑制ALKBH基因的表達，觀察前列腺癌細(xì)胞增殖、凋亡及侵襲能力的變

2、化；并統(tǒng)計分析ALKBH基因表達水平與患者預(yù)后之間的關(guān)系。為ALKBH的臨床應(yīng)用及作為基因治療靶點的可行性提供實驗依據(jù)。
　　方法
　　采用半定量RT-PCR和免疫印跡技術(shù)篩選ALKBH表達水平最高的前列腺癌細(xì)胞系，利用軟件設(shè)計靶向ALKBH基因mRNA的干擾序列，應(yīng)用BLAST軟件分析各條干擾序列的二級結(jié)構(gòu)及同源性從中篩選3條最佳的干擾片段。人工合成靶向ALKBH的siRNA轉(zhuǎn)錄模板后與質(zhì)粒載體連接，成功構(gòu)建3個RNA沉默

3、重組質(zhì)粒，命名為pSIREN-ALKBH-shRNA-1、2、3。在脂質(zhì)體的介導(dǎo)下將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染給前列腺癌細(xì)胞，采用免疫印跡技術(shù)和半定量RT-PCR檢測前列腺癌細(xì)胞ALKBH的表達情況，選取沉默效果最佳的重組質(zhì)粒進行后續(xù)實驗，將該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染前列腺癌細(xì)胞后，采用流式細(xì)胞儀和Transwell小室技術(shù)分別檢測前列腺癌細(xì)胞的細(xì)胞周期的變化，和侵襲能力的變化。同時采用半定量RT-PCR和免疫印跡技術(shù)檢測前列腺癌細(xì)胞中 c-Myc含量。制備前列

4、腺癌裸鼠移植瘤動物模型，在瘤體局部注射針對ALKBH基因的RNA干擾質(zhì)粒及脂質(zhì)體的混合物，觀察移植瘤的生長情況，采用半定量RT-PCR、免疫印跡技術(shù)和免疫組化檢測瘤組織中ALKBH的表達情況。采用免疫組化法檢測患者前列腺癌和良性前列腺增生組織中ALKBH的表達，分析其表達水平與患者臨床病理特點及預(yù)后的關(guān)系。
　　結(jié)果
　　采用半定量 RT-PCR分別檢測三種 RNAi重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的前列腺癌 LNCaP細(xì)胞后，結(jié)果示：細(xì)胞中A

5、LKBH的mRNA的相對表達量分別為0.412±0.05、0.189±0.01與0.134±0.02，與陰性對照組（1.099±0.12）及空質(zhì)粒組（0.991±0.15）相比，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），后兩種重組質(zhì)粒的沉默效果更佳，與第一組重組質(zhì)粒比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。Western blot檢測陰性對照組、空質(zhì)粒組及pSIREN-ALKBH-shRNA-2、3重組質(zhì)粒組中ALKBH蛋白的相對表達量分別為0.

6、755±0.12、0.812±0.19、0.157±0.07、0.112±0.04。兩種重組質(zhì)粒與陰性對照組及空質(zhì)粒組相比，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），比較之下，第三種重組質(zhì)粒的沉默效果更佳。將pSIREN-ALKBH-shRNA-3重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染前列腺癌LNCaP細(xì)胞，48小時后實驗組前列腺癌LNCaP細(xì)胞中ALKBH的染色強度、陽性細(xì)胞所占比例較對照組明顯減弱，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。陰性對照組、空質(zhì)粒組與實驗組前列

7、腺癌LNCaP細(xì)胞中c-Myc的mRNA的相對表達水平分別為0.103±0.018，0.101±0.012和0.092±0.015。三組前列腺癌LNCaP細(xì)胞中 c-Myc的表達水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。陰性對照組、空質(zhì)粒組與實驗組前列腺癌LNCaP細(xì)胞中c-Myc蛋白的相對表達水平分別為0.775±0.09、0.796±0.12和0.275±0.05，實驗組前列腺癌LNCaP細(xì)胞中c-Myc蛋白的表達水平顯著下降，與陰性對

8、照組和空質(zhì)粒組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。實驗組前列腺癌LNCaP細(xì)胞增殖速度明顯低于陰性對照組及空質(zhì)粒組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。Transwell小室結(jié)果表明轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒后前列腺癌LNCaP細(xì)胞穿透小室到達對側(cè)的遷徙細(xì)胞數(shù)與對照組相比明顯減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。陰性對照組、空質(zhì)粒組和實驗組前列腺癌LNCaP細(xì)胞中G0/G1期細(xì)胞所占比例分別為為（71.53±1.13）％、（69.78±1.23）

9、％和（31.04±1.01）％，實驗組前列腺癌LNCaP細(xì)胞中G0/G1期細(xì)胞所占比例最低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（ P<0.05）。S期細(xì)胞所占比例為（19.26±0.88）％、（20.54±0.67）％及（51.23±1.25）％，實驗組前列腺癌 LNCaP細(xì)胞中 S期細(xì)胞所占比例最高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。陰性對照組、空質(zhì)粒組和實驗組細(xì)胞的凋亡率分別為（2.21±1.65）%、（2.27±1.56）%及（6.28±1.56）

10、%，差別有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。將重組干擾質(zhì)粒注射到裸鼠移植瘤的局部，可見實驗組的移植瘤生長速顯著顯減緩，與陰性對照組、空質(zhì)粒組相比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。陰性對照組、空質(zhì)粒組和實驗組瘤組織中 ALKBH mRNA的相對表達量分別為0.088±0.016，0.112±0.022和0.043±0.005。實驗組瘤組織中ALKBH mRNA的相對表達量顯著較低，與陰性對照組和空質(zhì)粒組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）

11、。陰性對照組、空質(zhì)粒組和實驗組瘤組織中 ALKBH蛋白的相對表達量（ALKBH/GAPDH的灰度值比值）分別為0.884±0.11，0.775±0.18和0.135±0.07。實驗組瘤組織中 ALKBH蛋白的相對表達量較低，與陰性對照組和空質(zhì)粒組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。陰性對照組、空質(zhì)粒組和實驗組瘤組織中細(xì)胞的ALKBH蛋白陽性表達率分別為82.6%、79.8%和45.1%。實驗組瘤組織中細(xì)胞的 ALKBH蛋白陽性表達率

12、最高，與其他兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。采用Kaplan Meier單因素回歸分析軟件對前列腺癌患者進行統(tǒng)計結(jié)果顯示ALKBH蛋白表達水平與患者預(yù)后密切相關(guān)（P<0.05）。
　　結(jié)論
　　本實驗構(gòu)建成功針對 ALKBH的重組干擾質(zhì)粒，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染前列腺癌LNCaP細(xì)胞后可以檢測到細(xì)胞內(nèi)ALKBH的mRNA及蛋白的表達水平均明顯下降，細(xì)胞的細(xì)胞周期受到阻滯、增殖受到抑制、凋亡增加、侵襲能力下降。應(yīng)用重組質(zhì)?？?/p>