大鼠BTCe蛋白對(duì)體外培養(yǎng)胰島保護(hù)作用及對(duì)糖尿病大鼠降糖作用的研究.pdf

1、糖尿病是威脅人類健康的重要疾病。目前，全球20-79歲的糖尿病患者約有1.5億人，預(yù)計(jì)到2025年將達(dá)到3億。糖尿病人數(shù)占前三位的國家依次是：印度、中國和美國，患者總計(jì)為7000萬左右，將近全球糖尿病患者總數(shù)的一半<'1>。2000年全球范圍內(nèi)因糖尿病死亡的人數(shù)達(dá)到290萬，占所有死亡人數(shù)的5.2％，為第五大死因<'[2]>。最新的全國性流行病資料源于1996年的調(diào)查，我國糖尿病的患病率為3.2％，人數(shù)超過3000萬<'[3]>，由上世

2、紀(jì)80年代的0.16％,<'14>，經(jīng)歷短短10余年間增長了20倍。 糖尿病(1型、2型)的病因不清。目前只籠統(tǒng)歸結(jié)為由遺傳因素和環(huán)境因素造成的兩大病因：1.胰島功能損傷。2.胰島素抵抗。對(duì)于兩者地位的輕重曾展開過激烈的爭論。 這一爭論大致經(jīng)歷以下階段：在20世紀(jì)中葉，人們對(duì)糖尿病還知之甚少，普遍認(rèn)為患者體內(nèi)胰島素水平低下，是一種胰島素缺乏性疾病。80年代之后，發(fā)現(xiàn)多數(shù)2型糖尿病患者的基礎(chǔ)胰島素水平高于正常群體，存在著程

3、度不同的胰島素抵抗。胰島素抵抗是包括2型糖尿病在內(nèi)的代謝綜合征各組分的共同發(fā)病基礎(chǔ)<'[5]>。由于代謝綜合征危害嚴(yán)重，加之對(duì)胰島的研究相對(duì)薄弱，胰島素抵抗的地位被不斷提高。甚至有人提出：2型糖尿病是由胰島素抵抗引起的疾病，是2型糖尿病的首要病因<'[6]>。但近年來的一些基礎(chǔ)與臨床研究顯示了胰島在糖尿病發(fā)病中的重要地位。首先，眾多超重或肥胖人群存在不同程度的胰島素抵抗，但糖耐量正常。另外，對(duì)代謝綜合征的重新評(píng)價(jià)也使人們對(duì)胰島素抵抗的狂

4、熱漸趨冷靜訓(xùn)。臨床實(shí)驗(yàn)和尸檢資料均證實(shí)，2型糖尿病、甚至早在葡萄糖耐量受損(impaired glucose toleranceIGT)、空腹糖耐量受損(impaired fasting glucose IFG)階段就存在胰島B細(xì)胞功能的缺陷或組織學(xué)上的改變<'[8]>。胰島功能的損傷貫穿整個(gè)糖尿病的發(fā)生、發(fā)展。而近年來對(duì)胰島移植、胰島干細(xì)胞誘導(dǎo)等課題的濃厚興趣<'[9][10][11][12]>，也是胰島地位提升的具體表現(xiàn)。因此，有人

5、提出：胰島處于糖尿病病因?qū)W的核心地位<'[13][14]>。 拋開胰島和胰島素抵抗的地位之爭，胰島在糖尿病發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用是無可爭議的。揭示胰島分泌障礙的原因，加強(qiáng)修復(fù)胰島的功能都將對(duì)征服糖尿病具有現(xiàn)實(shí)意義。胰島的再生能力是目前探索的熱門課題<'[15][16]>，目前認(rèn)為主要有3個(gè)再生來源：1.胰島內(nèi)存在極少數(shù)具有增殖能力的細(xì)胞可復(fù)制、分裂(proliferation)<'【17]>。2．來源于胰腺內(nèi)的“干細(xì)胞” (

6、如導(dǎo)管上皮細(xì)胞可能存在“干細(xì)胞”)的分化(neogenesis)<'[18】【19】>。3．胰島內(nèi)存在的“干細(xì)胞”可轉(zhuǎn)化為胰島β細(xì)胞<'【2]>。對(duì)于胰島細(xì)胞的再生能力目前還沒有一個(gè)詳細(xì)、權(quán)威的描述<'[21]>。胰島細(xì)胞既不象表皮細(xì)胞那樣具有旺盛的增生能力，也不同于神經(jīng)元、骨骼肌細(xì)胞那樣處于永久的靜止?fàn)顟B(tài)。由于胰島細(xì)胞的再生能力在糖尿病發(fā)生、發(fā)展中處于關(guān)鍵地位，闡明胰島細(xì)胞的再生機(jī)制，激發(fā)、提升胰島細(xì)胞的再生能力一直是人們探索的焦點(diǎn)。

7、從20世紀(jì)80年代，人們就開始尋找“胰島再生相關(guān)基因／因子”。這類因子被認(rèn)為可能在胰島發(fā)生、發(fā)育，增殖，分泌調(diào)控等事件上扮演重要角色，可有效地促進(jìn)胰腺／胰島的增殖，加速損傷的修復(fù)<'[22]>。陸續(xù)發(fā)現(xiàn)的如Reg<'[23]>，IGF一1<'[24]>，INGAP<'[25]>，VEGF<'[26]>，GLP-1<'[27】[28]>等均可在一定程度促進(jìn)胰島的再生。 Betacellulin(BTC)是近年來逐漸受到關(guān)注的一個(gè)

8、胰島再生相關(guān)因子，屬表皮生長因子(EGF)家族，1993年首先由Shing從小鼠胰腺β細(xì)胞瘤細(xì)胞中克隆成功<'[29]>。BTC mRNA高表達(dá)于正常及腫瘤胰腺中。目前研究提示：1．BTC可促進(jìn)某些細(xì)胞轉(zhuǎn)化為胰島素分泌細(xì)胞<'[30]>。2．促進(jìn)胰島細(xì)胞的復(fù)制、增殖<'[31]>。3．BTC注入糖尿病動(dòng)物模型體內(nèi)可能通過促胰島再生起到緩解高血糖的作用<'[32]>。4．BTC基因的某些SNP可能與2型糖尿病的發(fā)生相關(guān)<'【33]>?？梢?/p>

9、，BTC可能是一個(gè)與胰島、糖尿病密切相關(guān)的因子。 BTC促胰島再生的作用基本得到肯定，但其作用機(jī)制不清。諸如：BTC促胰島增殖和促胰島干細(xì)胞分化的作用對(duì)促進(jìn)胰島再生疏輕疏重?BTC是通過erbB-1、erbB-4受體還是其特異受體發(fā)揮作用?BTC在糖尿病發(fā)生、發(fā)展過程中扮演什么樣的角色?BTC對(duì)胰島的直接作用如何?這些最基礎(chǔ)的問題目前仍未獲得明確的答案。 研究BTC的意義在于：1．目前的資料均提示BTC是一個(gè)促胰島再生

10、因子，挖掘其在胰島移植中的保護(hù)價(jià)值及對(duì)干細(xì)胞的誘導(dǎo)潛能，對(duì)于這兩個(gè)領(lǐng)域的研究都具有推動(dòng)作用。2．BTC在胰腺內(nèi)特異的高表達(dá)，很可能在胰腺／胰島的發(fā)生、發(fā)育、增殖、分泌等重要事件中起關(guān)鍵作用<'[34】[35]>，搞清BTC在這些環(huán)節(jié)所發(fā)揮的作用及其機(jī)制，對(duì)于揭示胰島的損傷、糖尿病的發(fā)生可能會(huì)提供極有價(jià)值的線索，也是糖尿病病因?qū)W研究的一個(gè)良好的切入點(diǎn)。3．BTC具有促胰島再生作用，具有成為糖尿病治療藥物的潛質(zhì)，這方面的研究也是一個(gè)值得深入

11、的領(lǐng)域。 本實(shí)驗(yàn)所研究的BTCe(the EGF—like domain of betacellulin)是BTC的重要功能片段，較全長BTC少30個(gè)氨基酸，可與erbB-1、erbB-4受體結(jié)合，其促細(xì)胞增殖的能力與全長無差異<'[36]>，但BTCe對(duì)于胰島／胰腺的作用目前尚無報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過原核表達(dá)的方法獲得大量有生物活性的BTCe蛋白，探討對(duì)體外培養(yǎng)大鼠胰島的影響作用，發(fā)現(xiàn)：1.BTC/BTCe對(duì)胰島無急性促分泌作用。2

12、.在胰島的長期培養(yǎng)過程中，BTC/BTCe可有效地延緩GSIS下降的幅度，對(duì)于胰島的分泌功能具有保護(hù)作用。但BTC/BTCe并未引起胰島內(nèi)關(guān)鍵基因insulin、glucagon、Glut-2和PDX-1表達(dá)水平的改變，提示BTC/BTCe的保護(hù)作用可能存在深層次的機(jī)制。為探討B(tài)TCe對(duì)糖尿病動(dòng)物高血糖的影響作用，采用裸質(zhì)粒的肌肉注射實(shí)現(xiàn)糖尿病大鼠的體內(nèi)轉(zhuǎn)染。質(zhì)粒轉(zhuǎn)染15—20天后，糖尿病大鼠的血糖出現(xiàn)明顯下降，糖耐量顯著改善。免疫熒光

13、顯示：胰腺內(nèi)出現(xiàn)了大量PDX-1陽性的導(dǎo)管細(xì)胞和胰島素染色陽性細(xì)胞。這些結(jié)果提示：BTCe可能是通過促進(jìn)胰腺內(nèi)導(dǎo)管細(xì)胞的增生和對(duì)某些前體細(xì)胞的誘導(dǎo)發(fā)揮對(duì)糖尿病大鼠高血糖的緩解作用，也可能存在對(duì)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的修復(fù)等更深層次的機(jī)制。之前，Ogata研究C端截短了17個(gè)氨基酸的BTC片段Betacellulin-δ4，認(rèn)為其具有促AR42J細(xì)胞分化為胰島素分泌細(xì)胞的功能<’[37]>。本實(shí)驗(yàn)選擇BTCe作為BTC研究的切入點(diǎn)，首先明確BTCe