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文檔簡介
1、作為世界上的第二大玉米生產國,我國玉米的種植面積和產量不斷增加,目前已超過水稻成為中國的第一大糧食作物。中國玉米生產長期處于自給自足的平衡狀態(tài),2010年、2012年中國先后成為玉米凈進口國,我國在玉米進出口關系上的轉變,使提高國內玉米產量的任務更加緊迫。玉米生長處于高溫、高濕季節(jié),雜草危害嚴重,化學除草是消除雜草危害、保證玉米增產增收的重要除草方式。草甘膦作為目前使用范圍最廣的滅生性除草劑,在殺死雜草的同時,對農作物同樣具有殺死作用。
2、通過植物基因工程育種使玉米獲得草甘膦抗性,是解決這一矛盾的有效手段。
本研究通過酶切連接法改造植物表達載體pCAMBIA3301-epsps,使抗草甘膦基因2mG2-epsps處于玉米泛素蛋白啟動子之后,用農桿菌介導法轉化玉米自交系18-599R及Hi-Ⅱ幼胚,并對幼胚轉化系統(tǒng)進行了優(yōu)化,獲得了T0代轉基因植株。通過對轉基因植株的PCR檢測和測序驗證,表明目的基因2mG2-epsps已整合到玉米基因組中。主要結果如下:
3、 1、植物表達載體pCAMBIA3301-epsps的改造。將pCAMBIA3301上草甘膦基因2mG2-epsps前的CaMV35S啟動子換成玉米泛素蛋白啟動子Ubiquitin啟動子。作為玉米自身基因的啟動子,用它驅動外源基因轉化玉米時,可以降低外源基因在轉基因個體中的拷貝數(shù),從而避免基因沉默現(xiàn)象的發(fā)生。
2、玉米幼胚作為遺傳轉化的外植體,通過影響出愈率來影響農桿菌介導玉米轉化效率。本研究用0.8-2.0 mm大小的幼胚
4、,在菌液濃度為OD600=0.4-0.6,浸染時間為10 min的條件下進行處理,恢復培養(yǎng)后統(tǒng)計出愈率。結果顯示,0.8-1.2 mm、1.2-1.5 mm、1.5-2.0 mm時的出愈率分別為93%、74%、38%,證明幼胚的大小為0.8-1.5 mm時均可以作為農桿菌介導玉米遺傳轉化的受體。
3、浸染后在恢復培養(yǎng)基中使用400mg/L的頭孢來抑制農桿菌的繼續(xù)生長,為保證抗性愈傷組織的形成,篩選培養(yǎng)基中同樣需要添加頭孢。實驗
5、中用200 mg/L、400 mg/L、600 mg/L的頭孢進行處理,在1.2 mmol/L草甘膦篩選培養(yǎng)基中篩選15天后統(tǒng)計抗性愈傷率,結果表明篩選培養(yǎng)基中仍使用400 mg/L的頭孢才能保證較高的抗性愈傷率。
4、菌液濃度、浸染時間及二者的交互作用均對浸染效率影響顯著,按照兩因素三水平設計9個處理,三次重復。實驗結果顯示,菌液濃度OD600=0.6,浸染時間為10 min時,1.5 mmol/L草甘膦篩選15天后的平均抗
6、性愈傷率最高,為37.33%。菌液濃度為OD600=0.4時,可適當延長浸染時間來提高浸染效率。
5、對18-599R和Hi-Ⅱ幼胚的農桿菌介導法進行比較,結果發(fā)現(xiàn)Hi-Ⅱ比18-599R更早形成愈傷,且愈傷組織增長速度更快,對草丁膦的篩選也更快作出反應。實驗中獲得78株18-599R再生植株,9株PCR檢查呈陽性,陽性率為11.5%;獲得18株Hi-Ⅱ再生植株,5株PCR檢查呈陽性,陽性率為27.8%。所以,Hi-Ⅱ比18-
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