農(nóng)桿菌介導(dǎo)的2mG2-epsps基因轉(zhuǎn)化玉米幼胚的研究.pdf

1、作為世界上的第二大玉米生產(chǎn)國(guó)，我國(guó)玉米的種植面積和產(chǎn)量不斷增加，目前已超過水稻成為中國(guó)的第一大糧食作物。中國(guó)玉米生產(chǎn)長(zhǎng)期處于自給自足的平衡狀態(tài)，2010年、2012年中國(guó)先后成為玉米凈進(jìn)口國(guó)，我國(guó)在玉米進(jìn)出口關(guān)系上的轉(zhuǎn)變，使提高國(guó)內(nèi)玉米產(chǎn)量的任務(wù)更加緊迫。玉米生長(zhǎng)處于高溫、高濕季節(jié)，雜草危害嚴(yán)重，化學(xué)除草是消除雜草危害、保證玉米增產(chǎn)增收的重要除草方式。草甘膦作為目前使用范圍最廣的滅生性除草劑，在殺死雜草的同時(shí)，對(duì)農(nóng)作物同樣具有殺死作用。

2、通過植物基因工程育種使玉米獲得草甘膦抗性，是解決這一矛盾的有效手段。
　　本研究通過酶切連接法改造植物表達(dá)載體pCAMBIA3301-epsps，使抗草甘膦基因2mG2-epsps處于玉米泛素蛋白啟動(dòng)子之后，用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化玉米自交系18-599R及Hi-Ⅱ幼胚，并對(duì)幼胚轉(zhuǎn)化系統(tǒng)進(jìn)行了優(yōu)化，獲得了T0代轉(zhuǎn)基因植株。通過對(duì)轉(zhuǎn)基因植株的PCR檢測(cè)和測(cè)序驗(yàn)證，表明目的基因2mG2-epsps已整合到玉米基因組中。主要結(jié)果如下:

3、　　1、植物表達(dá)載體pCAMBIA3301-epsps的改造。將pCAMBIA3301上草甘膦基因2mG2-epsps前的CaMV35S啟動(dòng)子換成玉米泛素蛋白啟動(dòng)子Ubiquitin啟動(dòng)子。作為玉米自身基因的啟動(dòng)子，用它驅(qū)動(dòng)外源基因轉(zhuǎn)化玉米時(shí)，可以降低外源基因在轉(zhuǎn)基因個(gè)體中的拷貝數(shù)，從而避免基因沉默現(xiàn)象的發(fā)生。
　　2、玉米幼胚作為遺傳轉(zhuǎn)化的外植體，通過影響出愈率來影響農(nóng)桿菌介導(dǎo)玉米轉(zhuǎn)化效率。本研究用0.8-2.0 mm大小的幼胚

4、，在菌液濃度為OD600=0.4-0.6，浸染時(shí)間為10 min的條件下進(jìn)行處理，恢復(fù)培養(yǎng)后統(tǒng)計(jì)出愈率。結(jié)果顯示，0.8-1.2 mm、1.2-1.5 mm、1.5-2.0 mm時(shí)的出愈率分別為93％、74％、38％，證明幼胚的大小為0.8-1.5 mm時(shí)均可以作為農(nóng)桿菌介導(dǎo)玉米遺傳轉(zhuǎn)化的受體。
　　3、浸染后在恢復(fù)培養(yǎng)基中使用400mg/L的頭孢來抑制農(nóng)桿菌的繼續(xù)生長(zhǎng)，為保證抗性愈傷組織的形成，篩選培養(yǎng)基中同樣需要添加頭孢。實(shí)驗(yàn)

5、中用200 mg/L、400 mg/L、600 mg/L的頭孢進(jìn)行處理，在1.2 mmol/L草甘膦篩選培養(yǎng)基中篩選15天后統(tǒng)計(jì)抗性愈傷率，結(jié)果表明篩選培養(yǎng)基中仍使用400 mg/L的頭孢才能保證較高的抗性愈傷率。
　　4、菌液濃度、浸染時(shí)間及二者的交互作用均對(duì)浸染效率影響顯著，按照兩因素三水平設(shè)計(jì)9個(gè)處理，三次重復(fù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，菌液濃度OD600=0.6，浸染時(shí)間為10 min時(shí)，1.5 mmol/L草甘膦篩選15天后的平均抗

6、性愈傷率最高，為37.33％。菌液濃度為OD600=0.4時(shí)，可適當(dāng)延長(zhǎng)浸染時(shí)間來提高浸染效率。
　　5、對(duì)18-599R和Hi-Ⅱ幼胚的農(nóng)桿菌介導(dǎo)法進(jìn)行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Hi-Ⅱ比18-599R更早形成愈傷，且愈傷組織增長(zhǎng)速度更快，對(duì)草丁膦的篩選也更快作出反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)中獲得78株18-599R再生植株，9株P(guān)CR檢查呈陽性，陽性率為11.5％;獲得18株Hi-Ⅱ再生植株，5株P(guān)CR檢查呈陽性，陽性率為27.8％。所以，Hi-Ⅱ比18-