簡(jiǎn)化的人纖溶酶原餅環(huán)區(qū)5基因的克隆及表達(dá)與初步鑒定.pdf

1、背景與目的：血管發(fā)生存在于許多病理演變過程中，如增殖性視網(wǎng)膜病變、心血管?。▌?dòng)脈粥樣硬化）、以及腫瘤的生長、浸潤和轉(zhuǎn)移等環(huán)節(jié)。血管發(fā)生是一個(gè)復(fù)雜的、由激活因子與抑制因子共同調(diào)控的過程。目前，在所報(bào)道的內(nèi)源性抑制因子中，血管抑素是最強(qiáng)的血管發(fā)生的負(fù)向調(diào)節(jié)因子之一，它是人纖溶酶原的內(nèi)源片段，由纖溶酶原的五個(gè)Kringle環(huán)中的前四個(gè)構(gòu)成，在體內(nèi)外的腫瘤模型試驗(yàn)均已證實(shí)了血管抑素能夠有效的抑制腫瘤生長。最近研究發(fā)現(xiàn)，與血管抑素由一個(gè)賴氨酸相連

2、的人纖溶酶原的第五個(gè)Kringle環(huán)，即人纖溶酶原Kringle5（Human plasminogenkringle 5，hPK-5），它的抗內(nèi)皮細(xì)胞遷移能力更強(qiáng)，能夠更有效的抑制由生長因子誘導(dǎo)的新生血管增殖，并能誘導(dǎo)部分腫瘤細(xì)胞凋亡。分子遺傳學(xué)研究表明，人纖溶酶原內(nèi)部的這5個(gè)Kringle環(huán)的蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)有50％左右的同源性。然而它們表現(xiàn)的生物學(xué)活性各不相同。完整的Kringlel-3區(qū)有較強(qiáng)的抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖活性，Kringl

3、e4的抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖作用較弱，而Kringle5區(qū)抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖和抗遷移能力都較強(qiáng)。這使得Kringle5的應(yīng)用價(jià)值更為突出。目前，hPK-5主要是通過基因工程重組技術(shù)獲得，其純化復(fù)雜，且得率較低，而且hPK-5的相對(duì)分子量仍偏大。因此，我們通過研究hPK-5的功能性區(qū)域及蛋白的空間結(jié)構(gòu)，刪除了hPK-5的核苷酸序列的N端和C端各部分殘基，保留了環(huán)狀結(jié)構(gòu)上的全部氨基酸，直接克隆出了簡(jiǎn)化后的hPK-5（predigested hPK-

4、5,predhPK-5），并將其與GST進(jìn)行融和表達(dá)。 方法：從肝癌患者術(shù)后的癌旁組織中提取總RNA，經(jīng)過合理設(shè)計(jì)引物，利用RT-PCR直接得到簡(jiǎn)化的hPK-5基因。將該基因克隆至原核表達(dá)質(zhì)粒pGEX-1λT，再將此重組載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，經(jīng)PCR檢測(cè)、酶切鑒定及測(cè)序鑒定陽性克隆。用IPTG誘導(dǎo)陽性克隆表達(dá)融合蛋白，SDS-PAGE觀察表達(dá)產(chǎn)物。再通過用特異性抗體做Western-Blotting進(jìn)一步鑒定融合表達(dá)蛋白。

5、 結(jié)果：簡(jiǎn)化的hPK-5基因的RT-PCR產(chǎn)物為264bp。通過PCR、酶切、測(cè)序等方法鑒定簡(jiǎn)化的hPK-5基因正確克隆至原核表達(dá)質(zhì)粒pGEX-1λT中。重組質(zhì)粒pGEX-1λT/predhPK-5在大腸桿菌JM109中成功地表達(dá)出了GST/predhPK-5融合蛋白，并通過免疫學(xué)測(cè)定，相對(duì)分子質(zhì)量約為3.6×10<'4>，與理論值3.58×10<'4>相符。目的蛋白表達(dá)量占菌體總蛋白的23.6％。結(jié)論成功克隆出來簡(jiǎn)化的hPK-