地鱉纖溶活性蛋白基因克隆及轉(zhuǎn)染表達(dá)對(duì)S180細(xì)胞作用的研究.pdf

1、地鱉蟲是一種藥用歷史悠久的中藥材，通過現(xiàn)代生物提取技術(shù)，本實(shí)驗(yàn)室從中提取出一種具有纖溶活性的蛋白酶，即地鱉纖溶蛋白。通過研究發(fā)現(xiàn)，該蛋白不僅有很好的溶栓效果，同時(shí)對(duì)許多腫瘤細(xì)胞具有很好的抑瘤作用。深入研究發(fā)現(xiàn)，該蛋白能夠抑制血管的生成，從而可截?cái)嗄[瘤細(xì)胞的營養(yǎng)來源，將腫瘤細(xì)胞“餓”死。本文采用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將地鱉纖溶蛋白基因轉(zhuǎn)入s180細(xì)胞中，通過其表達(dá)，觀察是否對(duì)癌細(xì)胞生長(zhǎng)有一定不利影響，以證明該蛋白的抑瘤作用。
　　 本實(shí)驗(yàn)通過

2、參照實(shí)驗(yàn)室調(diào)取的地鱉纖溶蛋白基因，選擇適宜載體克隆位點(diǎn)的酶切位點(diǎn)，設(shè)計(jì)適當(dāng)?shù)囊?，通過提取地鱉總RNA，反轉(zhuǎn)錄cDNA第一鏈，PCR調(diào)取地鱉纖溶蛋白酶，然后通過TA克隆將地鱉纖溶蛋白基因連接到pM19上，通過藍(lán)白篩選，挑選陽性克隆，進(jìn)行PCR驗(yàn)證，再通過雙酶切，提取地鱉纖溶蛋白基因片段，構(gòu)建pCDNA3.1(+)-EFP轉(zhuǎn)染s180細(xì)胞，在G418篩選壓力下，篩選穩(wěn)定表達(dá)系細(xì)胞。同時(shí)觀察記錄細(xì)胞形態(tài)。提取穩(wěn)定表達(dá)系細(xì)胞的胞內(nèi)蛋白，做SD

3、S-PAGE，分析細(xì)胞內(nèi)蛋白的表達(dá)情況。
　　 通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染pCDNA3.1(+)-EFP質(zhì)粒載體的s180細(xì)胞，細(xì)胞由梭形變?yōu)閳A形，同時(shí)細(xì)胞粘附性降低，貼壁生長(zhǎng)減弱，在細(xì)胞培養(yǎng)液內(nèi)出現(xiàn)絮狀“葡萄串樣”細(xì)胞簇。通過檢測(cè)發(fā)現(xiàn)地鱉纖溶蛋白能夠在s180細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，導(dǎo)致上述現(xiàn)象的產(chǎn)生。說明地鱉蟲纖溶蛋白具有抗腫瘤細(xì)胞粘附侵潤(rùn)，轉(zhuǎn)移等功效，同時(shí)表明地鱉纖溶蛋白基因可用來構(gòu)建抗腫瘤腫瘤基因治療的載體。但由于地鱉纖溶蛋白抗腫瘤的機(jī)制還