GEBP11短肽對胃癌轉移的抑制作用及其結合受體的篩選鑒定.pdf

1、【背景】
　　腫瘤血管靶向治療具有諸多優(yōu)點,如不易產生耐藥性、腫瘤抑制譜廣、藥物易于到達靶部位和毒性較低等,已經成為腫瘤治療研究領域的熱點。當前,腫瘤血管抑制治療的突出問題是缺乏特異性的針對腫瘤血管的靶分子,小分子短肽因其具有免疫原性低、與配體親和力高、毒性低、容易合成修飾等優(yōu)勢而成為關注的焦點。前期,我們課題組利用噬菌體肽庫篩選技術獲得與胃癌血管內皮細胞特異結合的短肽GEBP11,并證實其具有良好的腫瘤血管靶向性和抑制腫瘤血管生

2、成的作用,研究還發(fā)現短肽可調控腫瘤血管內皮細胞分子群的表達,影響腫瘤血管內皮細胞的凋亡、增殖、基質降解、遷移和粘附等,所以我們推測短肽可能通過調控腫瘤血管內皮細胞的分子群表達,影響腫瘤血管內皮細胞的凋亡、增殖、基質降解、遷移和粘附能力,進而影響腫瘤血管的生成,最終抑制腫瘤的生長和轉移。但是短肽發(fā)揮此抑制作用的機制是什么,最初與腫瘤血管表面的什么分子結合發(fā)揮此作用,即短肽在腫瘤血管表面的受體分子是什么,這些都不清楚。所以,本課題擬探討短肽

3、對胃癌細胞遷移、侵襲、運動和增殖能力的影響;分離、純化并鑒定與 GEBP11短肽特異性結合的受體,為研究短肽及其受體抑制腫瘤的分子機制奠定理論基礎。
　　【目的】
　　1.探討GEBP11對胃癌細胞遷移、侵襲、運動和增殖的影響,分析其抑制腫瘤的機制。
　　2.篩選GEBP11的結合受體,為探討其抑制血管生成的機制奠定基礎。
　　【方法】
　　1.體外遷移、侵襲、劃痕實驗和體內裸鼠實驗檢測不同濃度短肽對胃癌細

4、胞遷移侵襲能力的影響。
　　2.體外高內涵篩選實驗和MTT實驗檢測不同濃度短肽對胃癌細胞運動和增殖能力的影響。
　　3.Western blot方法檢測GEBP11對Co-HUVECs中MMP1和MMP10分子表達的影響。
　　4.質譜法、高效液相色譜法和免疫細胞熒光染色法鑒定生物素標記的GEBP11三聚體短肽。
　　5.Western blot方法檢測GEBP11三聚體短肽結合受體的理化性質。
　　6.免

5、疫共沉淀-質譜法分離、純化和鑒定GEBP11三聚體短肽的結合受體。
　　【結果】
　　1.探討GEBP11短肽對胃癌腫瘤細胞轉移的影響
　　(1)體外遷移、侵襲和劃痕實驗的結果顯示,與不加短肽對照組相比較,當短肽的濃度達到20μg/ml時,就可明顯的抑制MKN28M細胞的遷移、侵襲能力;當短肽的濃度增加到50μg/ml和100μg/ml時,該抑制效果仍較明顯;但當短肽的濃度繼續(xù)增大時,抑制效果并不再隨短肽濃度的增加而增

6、加。
　　(2)體內裸鼠實驗的結果顯示短肽可以抑制胃癌MKN28M細胞的肺臟轉移能力。
　　(3)體外高內涵篩選實驗和MTT實驗的結果顯示,與不加短肽對照組相比較,當短肽的濃度達到20μg/ml時,就可明顯的抑制MKN28M細胞的運動和增殖能力;當短肽的濃度增加到50μg/ml和100μg/ml時,該抑制效果仍較明顯;但當短肽的濃度繼續(xù)增大時,抑制效果并不再增加,與遷移、侵襲和劃痕實驗的結果類似。
　　(4) West

7、ern blot實驗證實短肽可降低腫瘤血管內皮細胞中MMP1和MMP10的表達。
　　2.分離純化并鑒定GEBP11短肽結合的受體
　　(1)質譜和高效液相色譜法和免疫細胞熒光染色法結果證實多聚體短肽為Bio-2PEG-(GEBP11)3和2PEG-(GEBP11)3。
　　(2) Western blot方法證實短肽所結合受體的位置約在36KD處。
　　(3)免疫共沉淀-質譜法結果顯示,GEBP11短肽結合的受

8、體可能為蛋白激酶 C受體1,即RACK1。
　　【結論】
　　1.GEBP11短肽可抑制胃癌MKN28M細胞的體外遷移、侵襲、運動和增殖能力,并可抑制胃癌MKN28M細胞在祼鼠體內轉移瘤灶的形成。
　　2.成功制備生物素標記的GEBP11三聚體短肽Bio-2PEG-(GEBP11)3。通過免疫沉淀、質譜分析等方法,初步鑒定GEBP11短肽的結合受體為蛋白激酶C受體1(RACK1)。
　　3.GEBP11短肽對胃癌