胃癌多藥耐藥逆轉(zhuǎn)短肽GMBP42受體的初步篩選及其功能研究.pdf

1、近年來(lái)，盡管腫瘤治療已有很大進(jìn)步，不斷研發(fā)新的抗腫瘤藥物、出現(xiàn)新的治療方案，但是治療效果仍不盡如人意。多藥耐藥（MDR），是腫瘤化療失敗的主要原因[1]。針對(duì)胃癌多藥耐藥，目前仍缺乏理想的耐藥程度判斷標(biāo)準(zhǔn)和有效的耐藥逆轉(zhuǎn)劑或調(diào)節(jié)劑，是亟待解決的重要問(wèn)題。以經(jīng)典耐藥分子p糖蛋白為靶點(diǎn)，雖已有四代逆轉(zhuǎn)劑，通過(guò)基礎(chǔ)和臨床實(shí)驗(yàn)證實(shí)能夠發(fā)揮逆轉(zhuǎn)耐藥的作用，但由于其毒副作用和不良的藥物代謝動(dòng)力學(xué)作用，尚未被應(yīng)用于臨床[2]。因此，探索新的胃癌耐藥逆

2、轉(zhuǎn)方法和解決策略，研發(fā)新的耐藥逆轉(zhuǎn)劑，對(duì)胃癌成功治療有著非常重大的意義。在藥物研發(fā)方面，小分子短肽有眾多優(yōu)點(diǎn)，具有應(yīng)用于臨床的優(yōu)勢(shì)，是目前研究的熱點(diǎn)領(lǐng)域[3]。前期研究中，我們課題組利用噬菌體隨機(jī)十二肽庫(kù)，通過(guò)體外生物淘選耐藥細(xì)胞和親本細(xì)胞，獲得了能特異結(jié)合于胃癌耐藥細(xì)胞的短肽GMBP42。體內(nèi)藥效學(xué)研究初步證實(shí)，GMBP42能夠在裸鼠體內(nèi)抑制耐藥腫瘤生長(zhǎng)，部分逆轉(zhuǎn)腫瘤的耐藥表型，提高腫瘤對(duì)化療藥物的敏感性。進(jìn)一步鑒定耐藥逆轉(zhuǎn)短肽GMB

3、P42的結(jié)合受體，深入研究其在耐藥中的作用及分子機(jī)制，對(duì)于全面認(rèn)識(shí)腫瘤耐藥機(jī)理有重要意義，并為研發(fā)新型多藥耐藥逆轉(zhuǎn)生物制劑奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和提供理論支持。本課題將在這方面展開(kāi)研究。
　　【目的】
　　1.鑒定GMBP42在耐藥細(xì)胞中的結(jié)合，獲得其受體的分布信息。
　　2.篩選GMBP42的結(jié)合受體，為探討GMBP42的作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。
　　3.明確GMBP42的耐藥逆轉(zhuǎn)作用，初步分析其作用機(jī)制。
　　【方法】

4、
　　1.免疫細(xì)胞化學(xué)染色方法觀察GMBP42在耐藥細(xì)胞的結(jié)合，明確受體的亞細(xì)胞定位。流式細(xì)胞儀分析GMBP42的受體在耐藥細(xì)胞的表達(dá)量。
　　2.免疫共沉淀純化和富集GMBP42結(jié)合的受體蛋白，質(zhì)譜分析初步篩選GMBP42結(jié)合受體。
　　3.MTT實(shí)驗(yàn)觀察GMBP42對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。
　　4.體外藥物敏感實(shí)驗(yàn)檢測(cè)GMBP42在細(xì)胞中對(duì)抗腫瘤藥物IC50值的影響。
　　5.阿霉素蓄積和潴留實(shí)驗(yàn)觀察GMBP

5、42對(duì)藥物在細(xì)胞內(nèi)蓄積和潴留的影響。
　　6.細(xì)胞凋亡分析GMBP42對(duì)細(xì)胞凋亡的影響。
　　7.RT-PCR方法檢測(cè)GMBP42對(duì)部分耐藥相關(guān)膜分子表達(dá)水平的影響。
　　8.Western-blot方法檢測(cè)GMBP42作用細(xì)胞后MDR1和凋亡相關(guān)分子（BCL-2,BAX）的表達(dá)情況。
　　【結(jié)果】
　　1.GMBP42與細(xì)胞的結(jié)合情況和結(jié)合受體的相關(guān)信息。1)免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果說(shuō)明GMBP42在耐藥細(xì)胞SG

6、C7901/VCR和SGC7901/ADR中呈陽(yáng)性反應(yīng)，胞膜和核周胞漿均可見(jiàn)明顯的陽(yáng)性顆粒（棕黃色或者棕褐色），在親本SGC7901細(xì)胞中呈陰性反應(yīng)。
　　2)流式細(xì)胞分析結(jié)果顯示GMBP42結(jié)合的受體在耐藥細(xì)胞SGC7901/VCR和SGC7901/ADR中表達(dá)量要明顯多于親本SGC7901細(xì)胞。
　　3)免疫共沉淀純化富集GMBP42結(jié)合的蛋白，質(zhì)譜分析初步篩選GMBP42結(jié)合受體。延伸因子1α（EEF1A，Elonga

7、tion factor 1-alpha）在兩個(gè)蛋白條帶中均檢測(cè)到，是我們所關(guān)注的受體候選分子。
　　2.GMBP42在逆轉(zhuǎn)耐藥中的作用和分子機(jī)制研究。
　　1)MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)GMBP42不影響耐藥細(xì)胞的正常生長(zhǎng)。
　　2)體外藥物敏感實(shí)驗(yàn)證實(shí)GMBP42可以降低耐藥細(xì)胞SGC7901/VCR和SGC7901/ADR阿霉素、5-氟尿嘧啶和絲裂霉素的IC50值，提高耐藥細(xì)胞對(duì)這些藥物的敏感性，而對(duì)順鉑的IC50值沒(méi)有影

8、響。
　　3)阿霉素蓄積和潴留實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，GMBP42作用耐藥細(xì)胞后，阿霉素蓄積和潴留的熒光強(qiáng)度要明顯強(qiáng)于對(duì)照組，說(shuō)明GMBP42能增加阿霉素在細(xì)胞內(nèi)蓄積和潴留。
　　4)FCM分析細(xì)胞的凋亡，加入GMBP42后的耐藥細(xì)胞，與對(duì)照組相比，凋亡指數(shù)增加，說(shuō)明GMBP42能夠促進(jìn)藥物誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡。
　　5)RT-PCR結(jié)果顯示加入GMBP42的耐藥細(xì)胞組，耐藥相關(guān)膜分子MDR1((P-gp)在RNA水平上表達(dá)下降。<

9、br>　　6)Western-blot結(jié)果顯示GMBP42作用后的耐藥細(xì)胞，從蛋白水平上耐藥相關(guān)膜分子MDR1(P-gp)的表達(dá)量下降，凋亡抑制基因BCL-2的表達(dá)降低，凋亡促進(jìn)基因BAX的表達(dá)升高。
　　【結(jié)論】
　　1.GMBP42與耐藥細(xì)胞高親和力結(jié)合，受體在耐藥細(xì)胞的表達(dá)量要明顯高于親本細(xì)胞。對(duì)GMBP42結(jié)合受體的初步篩選，共得到了19個(gè)候選蛋白分子，其中延伸因子1α（EEF1A，Elongation factor