胃癌多藥耐藥逆轉短肽GMBP42受體的初步篩選及其功能研究.pdf

1、近年來，盡管腫瘤治療已有很大進步，不斷研發(fā)新的抗腫瘤藥物、出現(xiàn)新的治療方案，但是治療效果仍不盡如人意。多藥耐藥（MDR），是腫瘤化療失敗的主要原因[1]。針對胃癌多藥耐藥，目前仍缺乏理想的耐藥程度判斷標準和有效的耐藥逆轉劑或調(diào)節(jié)劑，是亟待解決的重要問題。以經(jīng)典耐藥分子p糖蛋白為靶點，雖已有四代逆轉劑，通過基礎和臨床實驗證實能夠發(fā)揮逆轉耐藥的作用，但由于其毒副作用和不良的藥物代謝動力學作用，尚未被應用于臨床[2]。因此，探索新的胃癌耐藥逆

2、轉方法和解決策略，研發(fā)新的耐藥逆轉劑，對胃癌成功治療有著非常重大的意義。在藥物研發(fā)方面，小分子短肽有眾多優(yōu)點，具有應用于臨床的優(yōu)勢，是目前研究的熱點領域[3]。前期研究中，我們課題組利用噬菌體隨機十二肽庫，通過體外生物淘選耐藥細胞和親本細胞，獲得了能特異結合于胃癌耐藥細胞的短肽GMBP42。體內(nèi)藥效學研究初步證實，GMBP42能夠在裸鼠體內(nèi)抑制耐藥腫瘤生長，部分逆轉腫瘤的耐藥表型，提高腫瘤對化療藥物的敏感性。進一步鑒定耐藥逆轉短肽GMB

3、P42的結合受體，深入研究其在耐藥中的作用及分子機制，對于全面認識腫瘤耐藥機理有重要意義，并為研發(fā)新型多藥耐藥逆轉生物制劑奠定實驗基礎和提供理論支持。本課題將在這方面展開研究。
　　【目的】
　　1.鑒定GMBP42在耐藥細胞中的結合，獲得其受體的分布信息。
　　2.篩選GMBP42的結合受體，為探討GMBP42的作用機制奠定基礎。
　　3.明確GMBP42的耐藥逆轉作用，初步分析其作用機制。
　　【方法】

4、
　　1.免疫細胞化學染色方法觀察GMBP42在耐藥細胞的結合，明確受體的亞細胞定位。流式細胞儀分析GMBP42的受體在耐藥細胞的表達量。
　　2.免疫共沉淀純化和富集GMBP42結合的受體蛋白，質(zhì)譜分析初步篩選GMBP42結合受體。
　　3.MTT實驗觀察GMBP42對細胞生長的影響。
　　4.體外藥物敏感實驗檢測GMBP42在細胞中對抗腫瘤藥物IC50值的影響。
　　5.阿霉素蓄積和潴留實驗觀察GMBP

5、42對藥物在細胞內(nèi)蓄積和潴留的影響。
　　6.細胞凋亡分析GMBP42對細胞凋亡的影響。
　　7.RT-PCR方法檢測GMBP42對部分耐藥相關膜分子表達水平的影響。
　　8.Western-blot方法檢測GMBP42作用細胞后MDR1和凋亡相關分子（BCL-2,BAX）的表達情況。
　　【結果】
　　1.GMBP42與細胞的結合情況和結合受體的相關信息。1)免疫細胞化學結果說明GMBP42在耐藥細胞SG

6、C7901/VCR和SGC7901/ADR中呈陽性反應，胞膜和核周胞漿均可見明顯的陽性顆粒（棕黃色或者棕褐色），在親本SGC7901細胞中呈陰性反應。
　　2)流式細胞分析結果顯示GMBP42結合的受體在耐藥細胞SGC7901/VCR和SGC7901/ADR中表達量要明顯多于親本SGC7901細胞。
　　3)免疫共沉淀純化富集GMBP42結合的蛋白，質(zhì)譜分析初步篩選GMBP42結合受體。延伸因子1α（EEF1A，Elonga

7、tion factor 1-alpha）在兩個蛋白條帶中均檢測到，是我們所關注的受體候選分子。
　　2.GMBP42在逆轉耐藥中的作用和分子機制研究。
　　1)MTT實驗結果證實GMBP42不影響耐藥細胞的正常生長。
　　2)體外藥物敏感實驗證實GMBP42可以降低耐藥細胞SGC7901/VCR和SGC7901/ADR阿霉素、5-氟尿嘧啶和絲裂霉素的IC50值，提高耐藥細胞對這些藥物的敏感性，而對順鉑的IC50值沒有影

8、響。
　　3)阿霉素蓄積和潴留實驗結果顯示，GMBP42作用耐藥細胞后，阿霉素蓄積和潴留的熒光強度要明顯強于對照組，說明GMBP42能增加阿霉素在細胞內(nèi)蓄積和潴留。
　　4)FCM分析細胞的凋亡，加入GMBP42后的耐藥細胞，與對照組相比，凋亡指數(shù)增加，說明GMBP42能夠促進藥物誘導細胞發(fā)生凋亡。
　　5)RT-PCR結果顯示加入GMBP42的耐藥細胞組，耐藥相關膜分子MDR1((P-gp)在RNA水平上表達下降。<

9、br>　　6)Western-blot結果顯示GMBP42作用后的耐藥細胞，從蛋白水平上耐藥相關膜分子MDR1(P-gp)的表達量下降，凋亡抑制基因BCL-2的表達降低，凋亡促進基因BAX的表達升高。
　　【結論】
　　1.GMBP42與耐藥細胞高親和力結合，受體在耐藥細胞的表達量要明顯高于親本細胞。對GMBP42結合受體的初步篩選，共得到了19個候選蛋白分子，其中延伸因子1α（EEF1A，Elongation factor