Herceptin對NK細胞體外擴增和殺傷活性的影響及機制研究.pdf

1、目的:觀察IL-2+IL-15 NK細胞體外大規(guī)模培養(yǎng)對于不同細胞亞群的細胞表型、細胞擴增倍數(shù)、細胞表面活化受體及腫瘤細胞殺傷活性的影響，并初步探討其作用機制。在此基礎上加入Herceptin，通過比較Herceptin在NK細胞體外大規(guī)模培養(yǎng)過程中對于細胞擴增倍數(shù)、細胞表型、細胞表面活化受體表達、靶細胞殺傷、細胞因子分泌及粘附等方面的影響，探討Herceptin在NK細胞體外大規(guī)模擴增過程中對于不同細胞亞群生物學特點的影響及具體作用機

2、制。
　　方法:收集2012年2月至2013年3月期間天津醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院生物治療科乳腺癌患者外周血30例，用Ficoll法獲取PBMC。首先，用方案1（IL-2+IL-15）NK細胞體外擴增方案進行培養(yǎng)。觀察培養(yǎng)15d后的細胞擴增倍數(shù)、淋巴細胞亞群比例變化。流式細胞術檢測細胞免疫表型、細胞表面活化受體的表達。LDH釋放法和CD107a檢測不同細胞亞群對于HLA匹配或不匹配的靶細胞系的殺傷活性。在此基礎之上，分別用2種NK細胞

3、體外大規(guī)模擴增方案進行培養(yǎng):方案1（IL-2+IL-15）和方案2（Herceptin+IL-2+IL-15）。在體外培養(yǎng)過程的第0，5，10，15d分別通過流式細胞儀檢測各個細胞亞群表型及細胞表面活化受體的變化。流式細胞儀檢測體外培養(yǎng)15d后擴增倍數(shù)、NK細胞、CD3+CD56+NKT以及T細胞亞群比例。LDH釋放法和CD107a檢測不同方案擴增產物以及各個細胞亞群對于K562細胞系及多種靶細胞系(T47D、MDA-MB-231、SK

4、BR3、SKOV3、A549)的殺傷能力和作用機制?；罴毎ぷ髡緳z測擴增產物殺傷不同的靶細胞時，效應細胞與靶細胞之間粘附的情況。Elisa法檢測不同方案擴增產物殺傷多種靶細胞系時細胞因子IFN-γ、TNF-α和TGF-β分泌量的變化。
　　結果:在體外擴增15d之后，方案1、2的總細胞擴增倍數(shù)分別為37.6±2631，44.82±6.84; NK細胞的擴增倍數(shù)分別為89.60±57.17，102.81±94.06; CD3+CD5

5、6+NKT的擴增倍數(shù)257.01±149.73，362.74±208.86;T的擴增倍數(shù)37.18±16.84，43.20±14.75。方案1（IL-2+IL-15）體外擴增NK細胞時，NK細胞表面活化受體NKp30、NKp44、NKG2D升高，CD16降低具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);CD3+CD56+NKT細胞表面活化受體DNAM-1和NKG2D升高(P＜0.05);T細胞表面活化受體變化與CD3+CD56+NKT細胞相似，DNA

6、M-1和NKG2D表達升高(P＜0.05)。方案1中總擴增產物對于HLA-A不匹配的靶細胞系殺傷活性顯著高于殺傷HLA-A匹配的靶細胞系時的殺傷活性(P＜0.05)。方案2中Herceptin加入對于其總細胞擴增倍數(shù)以及各細胞亞群擴增倍數(shù)的影響無統(tǒng)計學意義，但是可以明顯提高擴增產物對于各種靶細胞系的殺傷活性，尤其是對于HLA不匹配但HER2+的靶細胞系的殺傷作用明顯(P＜0.05)。對于各個細胞亞群的細胞表型和細胞表面活化受體，與方案1

7、相比，方案2中NK細胞表面活化受體NKp44的表達升高[（68.83±12.89）％vs（86.95±7.18）％，P＜0.05]。同時，方案2中NK細胞以及CD3+CD56+NKT細胞對于HLA不匹配但是HER2+的靶細胞系的粘附作用明顯提高（P＜0.05）。方案2中擴增產物殺傷腫瘤細胞時IFN-γ和TNF-α的分泌量增加，TGF-β的分泌降低（P＜0.05）。
　　結論:方案1（IL-2+IL-15）不僅具有擴增NK細胞的作用

8、，同時具有擴增CD3+CD56+NKT細胞的作用，具有顯著增強的非MHC限制性的抗腫瘤殺傷作用。可以通過提高各細胞亞群表面活化受體的表達，來提高其擴增產物的殺瘤活性。方案2（IL-2+IL-15+Herceptin）在保證總擴增倍數(shù)和NK擴增倍數(shù)的基礎上，提高細胞表面活化受體NKp44的表達，提高擴增產物殺傷各種腫瘤細胞系時效靶細胞之間的粘附作用，以及細胞因子IFN-γ和TNF-α的分泌并降低TGF-β的分泌，從而提高擴增產物的殺瘤活性