小麥泛素系統(tǒng)關(guān)鍵組分基因TaUb2和TaPUB1的功能分析.pdf

1、小麥(Triticum aestivum L.)是世界上最重要的糧食作物之一。小麥在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中經(jīng)常受到各種逆境脅迫。泛素/26S蛋白酶體系統(tǒng)(UPS)是植物中最重要的蛋白質(zhì)周轉(zhuǎn)機(jī)制之一。該系統(tǒng)主要由泛素活化酶(E1)、泛素結(jié)合酶(E2)、泛素連接酶(E3)、26S蛋白酶體和泛素組成。研究發(fā)現(xiàn)UPS參與許多生物過(guò)程，包括信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞周期和逆境脅迫響應(yīng)等。
　　泛素是一個(gè)含有76個(gè)氨基酸的球狀蛋白，存在于幾乎所有的真核生物中，且

2、高度保守。它主要以兩種類型存在:單體泛素和多聚化泛素。在植物細(xì)胞中，游離態(tài)的泛素和結(jié)合態(tài)的泛素處于動(dòng)態(tài)平衡中。盡管細(xì)胞內(nèi)泛素水平相對(duì)較高，但是自由的未結(jié)合的泛素非常的少。在脅迫條件下，植物細(xì)胞會(huì)積累大量的異常和受損的蛋白質(zhì)。及時(shí)清除這些非正常蛋白具有重要意義，而這個(gè)過(guò)程受自由態(tài)泛素水平的影響。
　　E3連接酶是UPS系統(tǒng)的關(guān)鍵酶，它決定了被泛素化蛋白的特異性。根據(jù)亞基構(gòu)成和作用機(jī)制，植物中的E3主要有:HECT結(jié)構(gòu)域家族、RING

3、結(jié)構(gòu)域家族和U-box結(jié)構(gòu)域家族等。U-box結(jié)構(gòu)域最先在酵母中發(fā)現(xiàn)的，是一個(gè)大約含有75個(gè)氨基酸的高度保守的結(jié)構(gòu)域。已鑒定的許多含U-box結(jié)構(gòu)域的蛋白隨后都發(fā)現(xiàn)具有E3連接酶的活性。
　　本實(shí)驗(yàn)室之前克隆了小麥泛素基因TaUb2，并獲得了過(guò)表達(dá)煙草(Nicotiana tabacumL.)株系。本文我們利用過(guò)表達(dá)TaUb2煙草研究了該基因在植物生物脅迫耐性中的功能。同時(shí)，我們還從小麥中分離到一個(gè)新的U-box基因TaPUB1。

4、對(duì)該基因進(jìn)行序列比對(duì)并對(duì)其表達(dá)模式進(jìn)行分析。構(gòu)建真核表達(dá)載體，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤法轉(zhuǎn)化本生煙，從而獲得了TaP UB1過(guò)表達(dá)的本生煙植株。利用轉(zhuǎn)基因植株對(duì)基因在逆境適應(yīng)中的功能進(jìn)行了深入研究。主要結(jié)論如下:
　　1.TaUb2在植物生物脅迫耐性中的功能
　　(1)丁香假單胞桿菌Pst DC3000屬于革蘭氏陰性細(xì)菌，被廣泛地用于研究植物的生物脅迫響應(yīng)。Pst DC3000處理后，與野生型煙草相比，TaUb2過(guò)表達(dá)煙草葉片中

5、的細(xì)菌生物量減少且葉片壞死、萎黃現(xiàn)象較輕。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)Pst DC3000處理小麥能顯著上調(diào)內(nèi)源TaUb2的表達(dá)。這些結(jié)果表明TaUb2過(guò)表達(dá)煙草能夠提高對(duì)Pst DC3000的抗性。
　　(2)經(jīng)Pst DC3000處理后，轉(zhuǎn)基因植物的氣孔孔徑變小，僅為野生型煙草的1/2-2/3。同時(shí)，我們又對(duì)感染Pst DC3000的各個(gè)株系葉片進(jìn)行失水速率檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與野生型相比，過(guò)表達(dá)煙草的失水速率較慢，這與經(jīng)Pst DC3000處理后

6、過(guò)表達(dá)煙草葉片的氣孔孔徑較小一致。Pst DC3000處理后，與野生型相比，過(guò)表達(dá)煙草的電解質(zhì)外滲量和丙二醛含量較低，APX、POD和SOD的酶活升高。這些結(jié)果表明，氣孔開(kāi)度的減小和抗氧化能力的提高可能參與轉(zhuǎn)基因植株的抗病性。
　　(3)注射Pst DC3000后，轉(zhuǎn)基因煙草中觀察到更多的活性氧和超敏反應(yīng)。同時(shí)，Pst DC3000處理后，發(fā)現(xiàn)參與SAR信號(hào)途徑的幾個(gè)PR基因在轉(zhuǎn)基因煙草中上調(diào)幅度明顯高于野生型煙草。這些結(jié)果表明R

7、OS誘導(dǎo)的、HR激活的SAR可能參與轉(zhuǎn)基因植株的抗病性。
　　2.小麥U-box基因TaPUB1的克隆與功能研究
　　(1)通過(guò)同源克隆策略從小麥中分離到一個(gè)U-box基因TaPUB1(JX307854)。該基因cDNA全長(zhǎng)為1932bp，開(kāi)放閱讀框?yàn)?593bp，共編碼531個(gè)氨基酸。該蛋白的分子量約為57.8KDa，等電點(diǎn)為5.96。該蛋白的N端有保守的U-box結(jié)構(gòu)域和Prp19超家族，C端有幾個(gè)WD40重復(fù)片段。

8、r>　　(2)將p35S-TaPUB1-GFP融合蛋白在洋蔥和本生煙表皮中瞬時(shí)表達(dá)。通過(guò)熒光顯微鏡觀察到熒光蛋白分布在胞質(zhì)和細(xì)胞核中。
　　(3) qRT-PCR檢測(cè)TaPUB1在小麥不同部位的表達(dá)以及在各種外源激素和逆境脅迫處理下的內(nèi)源TaPUB1的表達(dá)模式。結(jié)果表明TaPUB1在小麥根、莖和葉中均有表達(dá)，其中葉片中的表達(dá)最豐富。NaCl、PEG6000、CdCl2、Pst DC3000等逆境脅迫均能誘導(dǎo)TaPUB1上調(diào)表達(dá)。外

9、源施加植物激素如ABA、SA、MeJA和Eth也可不同程度地誘導(dǎo)該基因的表達(dá)。
　　(4)將TaPUB1 cDNA全長(zhǎng)正向插入到植物表達(dá)載體pROK2的CaMV35S啟動(dòng)子的下游。利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤法轉(zhuǎn)化本生煙。通過(guò)抗性篩選、轉(zhuǎn)錄水平及蛋白水平的檢測(cè)，最終選取了OE9、OE10、OE113個(gè)過(guò)表達(dá)株系并用于進(jìn)一步的研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)TaPUB1提高了本生煙對(duì)鹽脅迫的耐性。鹽脅迫條件下，與野生型相比，過(guò)表達(dá)株系的種子萌發(fā)率較高

10、，而且發(fā)芽速度快;與野生型植株相比，過(guò)表達(dá)TaPUB1幼苗及成苗在鹽脅迫下表現(xiàn)出較長(zhǎng)的主根，較高的葉綠素含量和較好的生長(zhǎng)表型。這些說(shuō)明過(guò)表達(dá)TaP UB1提高了本生煙的耐鹽性。
　　(5)鹽脅迫下，過(guò)表達(dá)植株中積累較多的脯氨酸和可溶性糖，水勢(shì)較低，表明轉(zhuǎn)基因植株通過(guò)增加滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的積累，降低水勢(shì)，進(jìn)而在一定程度上緩解由鹽脅迫造成的水分脅迫。鹽脅迫還會(huì)對(duì)植物造成離子毒害。過(guò)表達(dá)株系通過(guò)減少Na+吸收，降低Na+/K+比率，進(jìn)而在一

11、定程度上維持離子平衡，減輕離子毒害。鹽脅迫存在的同時(shí)還伴隨著氧化脅迫。轉(zhuǎn)基因植株通過(guò)提高抗氧化酶的活性，及時(shí)清除ROS，進(jìn)而減輕由ROS引發(fā)的氧化傷害。在鹽處理時(shí)，一些滲透脅迫和抗氧化酶相關(guān)基因在轉(zhuǎn)基因植物中的表達(dá)水平明顯地高于野生型。
　　(6)過(guò)表達(dá)TaPUB1還能提高本生煙對(duì)水分脅迫、重金屬鎘的耐性，同時(shí)增加了本生煙對(duì)Pst DC3000的感病性。
　　(7)過(guò)表達(dá)TaPUB1影響本生煙的生長(zhǎng)發(fā)育。對(duì)轉(zhuǎn)基因本生煙的表型