自噬相關基因Beclin 1表達對惡性膠質瘤細胞凋亡影響的實驗研究.pdf

1、腦膠質瘤是中樞神經系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，約占全部腦腫瘤的45～55％。目前，腦膠質瘤的治療手段主要包括手術治療、放射治療、化學治療和綜合治療等，盡管近年來上述治療措施已取得長足進步，但由于膠質瘤呈浸潤性生長，與周圍腦組織無明顯分界且易于復發(fā)，且療效均不甚理想。新的治療手段如基因治療等雖有望成為治愈膠質瘤的途徑之一，但是目前仍缺乏理想可靠的治療靶標。因此尋找調控膠質瘤細胞惡性生物學行為的分子靶標，明確其在膠質瘤發(fā)病過程中的病理機制，已

2、成為神經外科領域的研究熱點之一。
　　 自噬相關基因(autophagy-related gene，Atg)調節(jié)的細胞自噬活性下降在腫瘤的形成中具有重要作用。Beclin1(Atg6)是重要的自噬調節(jié)基因，主要作用是通過與Vps34/PI3K形成復合物促進自噬， Bcl-2能與Beclin1結合抑制自噬活性。因為Beclin1與Bcl-2家族中抑制凋亡的蛋白結合，但不能與促凋亡蛋白結合，并且研究Beclin1的分子結構發(fā)現(xiàn)其具有

3、Bcl-2家族中促凋亡蛋白共有的BH3結構，所以Beclin1可能參與凋亡的調節(jié)。Beclin1被認為是腫瘤抑制基因，其雜合性缺失是細胞發(fā)生惡性轉化的原因之一。Beclin1抑制腫瘤的作用可能是提高腫瘤細胞自噬活性。Yue等應用Beclin1基因敲除小鼠的胚胎干細胞，發(fā)現(xiàn)Beclin1完全缺失小鼠死于胚胎早期，Beclin1雜合性缺失小鼠雖然表型正常，但體內細胞自噬活性降低，而且自發(fā)腫瘤發(fā)生率高。Liang等將Beclin1穩(wěn)定轉染MC

4、F-7細胞株后，發(fā)現(xiàn)自噬空泡的數(shù)量增加，癌細胞體外增殖能力及惡性表型下降，并且在裸鼠中腫瘤形成能力降低。實驗發(fā)現(xiàn)化療能引發(fā)細胞自噬性死亡，而在凋亡抑制細胞中自噬誘導劑可上調Beclin1具有治療作用。Beclin1抑制腫瘤不僅誘發(fā)細胞自噬性死亡，而且能停滯細胞周期，抑制細胞增殖，誘導腫瘤細胞凋亡，抑制腫瘤壞死及炎癥擴散，預防細胞基因組突變。Beclin1基因還和一些腫瘤相關信號傳導通道關系密切，如PTEN通道和Rb信號傳導通道都與Bec

5、lin1不同程度相關。因此，探討B(tài)eclin1參與腦膠質瘤發(fā)生發(fā)展以及惡變的分子病理機制，尤其是在細胞自噬和凋亡中的作用，有助于明確膠質瘤的惡性生物學行為及機理，有望為膠質瘤的臨床治療提供新的分子靶標。
　　 本研究擬通過觀察Beclin1在不同病理級別腦膠質瘤以及膠質瘤細胞株中的確切表達情況，并通過過表達和敲減Beclin1在膠質瘤細胞株中的表達，研究Beclin1在惡性膠質瘤細胞自噬尤其是凋亡方面的作用。實驗共分為三個部分：

6、第一部分，觀察Beclin1在腦星形細胞腫瘤組織中的蛋白表達水平以及與病理級別的相關性；第二部分，觀察Beclin1在U251和U87腦膠質瘤細胞株中的mRNA和蛋白表達水平及相關蛋白的表達，以及構建Beclin1蛋白表達抑制和過表達的U87細胞株和檢測相關蛋白的結合情況；第三部分，研究Beclin1在U87細胞自噬、凋亡和增殖中的作用。
　　 第一部分Beclin1在星形細胞腫瘤組織中的表達
　　 目的：本研究檢測自噬

7、相關基因Beclin1在星形細胞腫瘤中的表達情況，探討其與星形細胞腫瘤病理和臨床表現(xiàn)的相關性及意義。
　　 方法：用免疫組化和(或)免疫印跡法檢測62例不同級別的星形細胞腫瘤Beclin1蛋白表達，并結合臨床和病理因素進行分析。
　　 結果：免疫組化顯示Beclin1蛋白在星形細胞腫瘤胞質中表達強弱隨腫瘤級別升高而降低，在胞核中則相反。免疫印跡法檢測高級別星形細胞腫瘤(Ⅲ/Ⅳ級)Beclin1平均光密度比值小于低級別腫瘤

8、(Ⅰ/Ⅱ級，p=0.036)。LC3B-Ⅰ在不同級別的星形細胞腫瘤中表達無明顯差異，但LC3B-Ⅱ在膠母細胞瘤中的平均光密度比值低于其他級別的腫瘤(p=0.030)。Beclin1和LC3B-Ⅱ高表達者的生存率有升高趨勢，兩者在星形細胞腫瘤中表達正性相關(p=0.035)。
　　 結論：Beclin1和LC3B-Ⅱ在膠母細胞瘤中的表達下調，自噬活性的改變可能與星形細胞腫瘤的發(fā)生、發(fā)展相關。
　　 第二部分Beclin1在

9、惡性膠質瘤細胞系中的表達
　　 目的：研究Beclin1、Bcl-2家族蛋白和Vps34在膠質瘤細胞系U251和U87中的表達和蛋白之間的結合情況；研究Beclin1在U87細胞株經過表達或RNA干擾后與Bcl-2家族蛋白和Vps34結合情況。
　　 方法：用脂質體法將表達Beclin1siRNA和Beclin1基因質粒分別轉染U87細胞株，鑒定轉染效率和細胞Beclin1蛋白表達。應用real-time PCR檢測Be

10、clin1在膠質瘤細胞系U251和U87中的mRNA表達水平，應用免疫印跡方法研究Beclin1、Bcl-2家族蛋白和Vps34在膠質瘤細胞系中的蛋白表達水平，應用免疫共沉淀檢測Beclin1與Bcl-2家族蛋白和Vps34之間的結合情況。
　　 結果：Beclin1siRNA和Beclin1基因表達的質粒在轉染進入U87細胞后抑制和過表達效果較好。RT-PCR和免疫印跡結果提示Beclin1 mRNA和蛋白表達水平在膠質瘤細胞

11、系U251和U87中明顯下調。免疫印跡提示Bcl-2家族蛋白在U251和U87中明顯上調(P＜0.05)。Beclin1和Vps34復合物能在各處理組U87中發(fā)現(xiàn)；在各對照組和RNA干擾后的U87中檢測免疫共沉淀未發(fā)現(xiàn)Beclin1分別與Bcl-2、Bcl-xL形成復合物，而在過表達Beclin1的U87中檢測出Beclin1分別與Bcl-2、Bcl-xL形成復合物。
　　 結論：Beclin1在所有被檢測的膠質瘤細胞系中，其m

12、RNA和蛋白表達水平明顯低于正常膠質細胞，且Bcl-2家族蛋白在U87細胞中表達增高。U87中Beclin1與Vps34能形成復合物，在Beclin1過表達時Beclin1才與Bcl-2類似蛋白形成復合物。不同處理組之間Beclin1蛋白結合變化可能是Beclin1參與調節(jié)自噬和凋亡作用的機制。
　　 第三部分Beclin1表達對膠質瘤細胞自噬、凋亡和增殖的作用
　　 目的：研究過表達或抑制Beclin1對U87膠質瘤細

13、胞株自噬、凋亡和增殖的影響；以及Beclin1在凋亡通路中的具體作用。
　　 方法：利用第二部分中U87細胞株的不同處理組培養(yǎng)48小時，采用免疫印跡檢測LC3、p62在各組的表達；用Hoechst33258染色及流式細胞儀測定各組凋亡細胞比例；氚標胸腺嘧啶脫氧核苷(trituum-labelled thymidine，3H-TdR)摻入檢測各組細胞增殖率。用免疫熒光和免疫印跡檢測各組細胞色素C的分布和表達情況；用免疫印跡檢測活性

14、caspase3/8/9表達；用免疫熒光檢測Beclin1和caspase3在細胞中的表達。
　　 結果：LC3-Ⅱ在過表達組呈高表達；在抑制組呈低表達。P62在過表達組呈低表達；抑制組呈高表達。Hoechst33258染色及流式細胞儀測定顯示過表達組凋亡細胞比例增高；其他各組無明顯變化。3H-TdR法顯示過表達組細胞增殖減緩，其他各組無明顯變化。免疫熒光顯示過表達組細胞色素C彌散分布于細胞中；其他各組細胞色素C分布比較集中且僅

15、限于胞質。免疫印跡發(fā)現(xiàn)過表達組胞質中細胞色素C有表達，其他各組未見明顯表達。免疫印跡檢測顯示過表達組活性caspase3/9表達增高，caspase8在各組間無明顯差別。免疫熒光顯示Beclin1和caspase3在過表達Beclin1的U87細胞中的表達增加，并有相關性。
　　 結論：在Beclin1抑制組中細胞自噬活性下降，凋亡活性無明顯變化，細胞增殖無明顯變化。而過表達組自噬活性增強，凋亡活性增強，細胞增殖減緩。過表達組胞