自噬-Cathepsin L活性對(duì)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞輻射抗性影響的體內(nèi)外研究.pdf

1、目的：本研究旨在探討調(diào)節(jié)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞Cathepsin L及自噬活性對(duì)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞(glioma stem cells，GSCs)輻射敏感性的影響及Cathepsin L及自噬活性對(duì)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞與輻射抗性的關(guān)鍵聯(lián)系。
　　 方法：建立GSCs體外培養(yǎng)體系和裸小鼠皮下及原位移植瘤模型，用Cathespin L抑制劑Z-FY-DMK或白藜蘆醇(Resveratrol)及SiRNA Cathespin L處理GSCs，再給予不同劑量的

2、X線照射?？寺⌒纬蓪?shí)驗(yàn)檢測(cè)各處理組GSCs的放射敏感性差異。Hoechst 33258熒光染色、流式細(xì)胞術(shù)Annexin V-FITC/PI檢測(cè)細(xì)胞凋亡及凋亡率。JC-1試劑盒檢測(cè)GSCs的線粒體膜電位、免疫熒光法和免疫組化法檢測(cè)各處理組中GSCs干細(xì)胞表面標(biāo)志相關(guān)蛋白的改變、單細(xì)胞凝膠電泳反映輻射后DNA的損傷修復(fù)情況、免疫熒光法和Western blot檢測(cè)各處理組中GSCs的DNA損傷修復(fù)相關(guān)蛋白(DNA-PKcs、p-ATM)、

3、LC3、Bcl-2的表達(dá)、HE染色分析各組移植瘤的組織學(xué)形態(tài)差異、MDC染色、透視電鏡檢測(cè)GSCs及各組移植瘤組織內(nèi)的自噬小體，自噬溶酶體的改變。
　　 結(jié)果：抑制GSCs Cathepsin L活性聯(lián)合X射線處理組與其他各處理組相比存活分?jǐn)?shù)降低(P＜0.05)，細(xì)胞凋亡率顯著增加(P＜0.05)；聯(lián)合處理組的GSCs線粒體膜電位下降。免疫熒光結(jié)果顯示，聯(lián)合治療組和單純給藥組的干細(xì)胞表面標(biāo)志表達(dá)減少；單細(xì)胞凝膠電泳結(jié)果和γH2A

4、X免疫熒光結(jié)果顯示，聯(lián)合治療組中GSCs的DNA損傷修復(fù)能力減弱；Western Blot結(jié)果顯示，聯(lián)合治療組GSCsDNA損傷修復(fù)相關(guān)蛋白(DNA-PKcs、p-ATM)的表達(dá)降低。裸鼠移植瘤實(shí)驗(yàn)中，聯(lián)合治療組的腫瘤相對(duì)體積與其它組均有顯著差異(p＜0.05)，HE染色可見聯(lián)合治療組腫瘤生長(zhǎng)局限，與周圍正常腦組織界限清楚，免疫組化法顯示聯(lián)合治療組和單純給藥組的細(xì)胞的干細(xì)胞表面標(biāo)志表達(dá)減少。
　　 Resveratrol處理GS

5、Cs再X射線處理組與其他各處理組相比存活分?jǐn)?shù)降低(P＜0.05)，細(xì)胞凋亡率顯著增加(P＜0.05)；免疫熒光法分析結(jié)果顯示聯(lián)合治療組和單純給藥組的細(xì)胞的干細(xì)胞表面標(biāo)志表達(dá)減少；單細(xì)胞凝膠電泳結(jié)果顯示，聯(lián)合治療組中GSCs的DNA損傷修復(fù)能力減弱；Western Blot結(jié)果顯示，聯(lián)合治療組Cathepsin L活性降低。MDC染色和透視電鏡檢測(cè)發(fā)現(xiàn)聯(lián)合治療組細(xì)胞中自噬小體明顯增多。在裸鼠移植瘤實(shí)驗(yàn)中，聯(lián)合治療組腫瘤相對(duì)體積與其余各組有

6、顯著差異(p＜0.05)，Western Blot結(jié)果顯示聯(lián)合治療組Cathepsin L活性降低，Bcl-2表達(dá)降低，LC3-Ⅱ表達(dá)增加；透視電鏡檢測(cè)發(fā)現(xiàn)聯(lián)合治療組腫瘤細(xì)胞中自噬小體顯著增多。
　　 結(jié)論：本課題研究發(fā)現(xiàn)，體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)中抑制Cathepsin L活性后再聯(lián)合X射線處理GSCs，GSCs出現(xiàn)生長(zhǎng)阻滯，GSCs移植瘤生長(zhǎng)局限，干細(xì)胞表面標(biāo)志表達(dá)減少，出現(xiàn)凋亡和線粒體膜電位下降，DNA損傷修復(fù)減慢，DNA修復(fù)相關(guān)蛋