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文檔簡介
1、C型利尿鈉肽對小鼠Cajal間質(zhì)細胞起搏電流的影響1893年,西班牙神經(jīng)解剖學(xué)家Cajal用甲基藍及嗜銀染色法在胃腸道神經(jīng)系統(tǒng)(entericnervoussystem,ENS)中觀察到一類特殊的間質(zhì)細胞,命名為Cajal間質(zhì)細胞(interstitialcellsofCajal,ICC)。ICC是ENS中的一種非神經(jīng)但與神經(jīng)有關(guān)的特殊間質(zhì)細胞,胃腸道平滑肌的運動形式在很大程度上取決于ICC的活動。已有眾多研究表明,許多胃腸道平滑肌的靜
2、息電位不穩(wěn)定,表現(xiàn)為緩慢的起伏波動,即周期性去極化和復(fù)極化,稱為慢波(slowwave,SW),也稱基本電節(jié)律(BasicElectricRhythm,BER)。BER決定著平滑肌收縮節(jié)律,調(diào)控著胃腸道運動發(fā)生的時間、地點、頻率、和方向。近年來的單細胞記錄和分子水平的研究證明,胃腸道無論是縱行肌還是環(huán)行肌均不具有發(fā)動SW的能力。慢波由存在于縱行肌和環(huán)行肌之間的ICC產(chǎn)生,這些細胞具有成纖維細胞和平滑肌細胞的特性,并與縱環(huán)兩層形成縫隙連接
3、,可將慢波傳到平滑肌。近年的許多研究表明,ICC是腸道慢波的起搏者,在神經(jīng)肌肉信號傳遞中起調(diào)節(jié)作用,而且與某些胃腸動力性疾病的發(fā)病有關(guān)。 利尿鈉肽(natriureticpeptides)家族是一類具有利尿、排鈉,舒張血管,降低血壓以及調(diào)節(jié)水鹽和電解質(zhì)平衡等作用的多肽。利尿鈉肽家族的受體有3種,分別是A型、B型和C型利尿鈉肽受體(natriureticpeptidesreceptors,NPR)。利尿鈉肽通過與其受體結(jié)合而發(fā)揮作
4、用。CNP作為利尿鈉肽家族中的一員,是由Sudoh等人于1990年首先在豬的大腦中發(fā)現(xiàn)的,是一種具有22個氨基酸殘基的肽類。CNP分布廣泛,存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、泌尿生殖系統(tǒng)、消化系統(tǒng)以及皮膚和粘膜等,幾乎遍布于整個機體。CNP作為一種局部調(diào)節(jié)因子通過自分泌和旁分泌的方式發(fā)揮作用,除了可以利尿、排鈉,舒張血管和內(nèi)臟平滑肌,降低血壓以及調(diào)節(jié)水鹽、電解質(zhì)平衡以外,還可以抑制血管平滑肌的增殖調(diào)節(jié)腎素血管緊張素的活性和調(diào)節(jié)腸液和膽汁等
5、消化液的分泌。此外還參與高血壓、慢性心衰、慢性腎衰、動脈粥樣硬化和肺纖維化等一系列病理過程的調(diào)節(jié)。CNP的許多作用是通過調(diào)節(jié)細胞膜上的離子通道,影響細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)來實現(xiàn)的。 我室以往的研究表明:在大鼠胃的各個部位都有利尿鈉肽受體(natriureticpeptidereceptor,NPR)存在,并且在胃竇部最多;CNP可以抑制豚鼠胃竇部平滑肌的收縮活動,在此過程中細胞內(nèi)cGMP生成明顯增加;CNP通過cGMP-PKG途徑明顯增
6、加平滑肌細胞鈣激活鉀通道電流。ICC是胃腸道平滑肌節(jié)律性運動的起搏細胞,直接影響胃腸運動的頻率和幅度。然而,CNP對胃腸道平滑肌運動的抑制性調(diào)節(jié)是否通過對ICC起搏電流的影響來實現(xiàn),國內(nèi)外還沒有研究報道。因此,本工作利用傳統(tǒng)全細胞膜片鉗技術(shù)在培養(yǎng)的小鼠胃和小腸ICC上記錄起搏電流(pacemakercurrent)并觀察了CNP對這些電流的影響。 實驗結(jié)果如下:1.培養(yǎng)24h后的ICC在倒置顯微鏡下觀察可見:ICC已貼壁,成三角
7、形或梭形。72h后可見ICC有梭形、三角形,核大,核周有少量胞漿。自核區(qū)胞體發(fā)出2~4條長突起,并與鄰近細胞胞體及ICC突起相互連接成網(wǎng)絡(luò)狀。 2.用c-kit免疫熒光染色后,在激光共聚焦顯微鏡或熒光顯微鏡下可以觀察到,ICC表面酪氨酸激酶受體c-kit表達呈陽性,胞體和突起均明顯著色。 3.在傳統(tǒng)的全細胞膜片鉗模式,將膜電位鉗制在-60mV的條件下,在體外培養(yǎng)的胃及小腸ICC上可以記錄到自發(fā)而節(jié)律性內(nèi)向電流,即起搏電流
8、。胃竇部單一ICC的起搏電流振幅為130.78±9.59pA,頻率為2.6±0.25次/分;胃竇部網(wǎng)絡(luò)狀I(lǐng)CC的起搏電流振幅為226.78±28.31pA,頻率為3.6±0.51次/分;小腸部單一ICC的起搏電流振幅為79.65±11.23pA,頻率為6.5±0.43次/分;小腸部網(wǎng)絡(luò)狀I(lǐng)CC的起搏電流振幅為272.32±38.84pA,頻率為16.25±0.95次/分。在胃和小腸ICC之間以及單個ICC和ICC網(wǎng)絡(luò)之間,電流幅度、頻率
9、有著明顯的差異(p<0.05,n=6)。 4.在傳統(tǒng)的全細胞膜片鉗模式,將膜電位鉗制在-60mV的條件下,通過增加電極內(nèi)液中EGTA濃度達到10mmol?L-1使細胞內(nèi)游離鈣降低時,可以激活I(lǐng)CC的內(nèi)向電流。 5.鈣調(diào)蛋白抑制劑對ICC起搏電流具有明顯的激活作用。當(dāng)細胞外給予W-750μmol?L-1時,起搏電流振幅由原來的48.18±1.34PA增加到137.175±11.54PA,增加了187.36±32.95%,鉗
10、制電流增加93.79±18.78PA。當(dāng)W-7被洗脫后起搏電流幅度和鉗制電流緩慢恢復(fù)。6.在激光共聚焦顯微鏡下免疫熒光染色的ICC細胞膜上利尿鈉肽受本A(natriureticpeptidereceptorA,NPR-A)和利尿鈉肽受體B(natriureticpeptidereceptorB,NPR-B)表達呈陽性,胞體和突起均明顯著色,部分細胞發(fā)出長的凸起,并發(fā)現(xiàn)在小腸的表達明顯多于胃竇部。 7.CNP對ICC起搏電流幅度具
11、有明顯的抑制作用,并具有劑量依賴性。當(dāng)CNP濃度為0.01μmol?L-1,0.1μmol?L-1,1μmol?L-1時,分別使起搏電流抑制到對照組的76.06±1.51%;38.24±3.74%;29.60±1.93%。以上結(jié)果提示: 1.小鼠胃和小腸ICC產(chǎn)生的起搏電流頻率與小鼠胃和小腸自律運動的頻率非常接近;網(wǎng)絡(luò)ICC產(chǎn)生的起搏電流比單個ICC穩(wěn)定、幅度高、頻率快。 2.ICC內(nèi)游離鈣濃度的降低是產(chǎn)生起搏電流的重要
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