黑乳海參膠原蛋白活性肽的研究.pdf

1、海參(sea cucumber, holothurians)歸屬無脊椎動物棘皮動物門,以其較高的營養(yǎng)價值和藥學(xué)價值而被列為“八珍”之一。全世界約有1000多種海參,我國約有140多種,可供食用者約有40多種,其中10種具有較高的商品價值。黑乳海參( Holothuria nobilis Selenka)分布于我國西沙群島和海南島南部,澳大利亞西部海域,是一種品質(zhì)優(yōu)良的大型食用海參,體壁較厚。
　　目前國內(nèi)外對海參活性成分的研究主要

2、集中于海參多糖、海參皂苷、脂質(zhì)以及微量元素等,對海參膠原蛋白及其活性肽的研究較少。崔鳳霞等人對海參膠原蛋白活性肽進行了一些研究,但大都集中在相對分子質(zhì)量為1000左右小分子肽的研究上,而對大分子膠原蛋白肽的研究未見報道。
　　本論文以黑乳海參為研究對象,采用風(fēng)味酶對處理后的黑乳海參進行酶解制備膠原蛋白活性多肽,結(jié)合各種分離技術(shù)提取純化膠原蛋白多肽,研究其氨基酸組成、氨基酸序列和體內(nèi)外的各種生理活性。本文主要研究結(jié)果如下:
　

3、?、秉\乳海參膠原蛋白酶解制備得到目標膠原多肽HNCP-F-A(Mw:1-10kDa),采用超濾、凝膠柱層析和HPLC方法,分離制備得到三個組分:HNCP-F-Aa、HNCP-F-Ab、HNCP-F-Ac,采用MALDI-TOF-MS測得三個組分的多肽質(zhì)量圖譜及主要相對分子質(zhì)量:2806Da、7201Da、1532Da。
　?、材繕四z原多肽的氨基酸組成分析結(jié)果表明本實驗制備得到的黒乳海參膠原多肽主要含有甘氨酸(Gly)、丙氨酸(Al

4、a)、谷氨酸(Glu)、脯氨酸(Pro)、羥脯氨酸(Hyp)。其中鮮味氨基酸、藥效氨基酸、必需氨基酸的總量占膠原多肽氨基酸總量的摩爾百分比分別為65.1％、58.08%、24.96%。因此黒乳海參膠原多肽氨基酸組成齊全,味道鮮美,具有很高藥用價值。
　?、巢捎肕ALDI-TOF/TOF MS-MS方法對黒乳海參膠原多肽樣品HNCP-F-Ac中8種多肽進行denovo氨基酸測序,序列結(jié)果分別為:IPGYIMSSSNHDGGAP;GS

5、NHSDSY-WLMPR;PDMGVNSKYVGHLR;TMLAMVRVHLYLR;DGNLYMGHRMMCSGY;DWEV-AYDV HECPMCK;GDPKDDLFWVVCCKCLK。黒乳海參膠原多肽樣品HNCP-F-Ab條帶1的部分氨基酸序列為:NH2-Gly-Ala–Pro-Gly-Pro-Met-Gly-Met-Met-Gly。
　?、春谌楹⒛z原多肽對二苯代苦味肼基自由基(DPPH·)﹑羥基自由基(·0H)﹑超氧陰離子

6、自由基(O2·–)的清除作用表明,黑乳海參膠原多肽能有效清除二苯代苦味肼基自由基﹑羥基自由基﹑超氧陰離子自由基,其IC50值分別為5.78mg/ml﹑4.20mg/ml、0.27mg/ml。
　?、岛谌楹⒛z原多肽對D-半乳糖模型小鼠體內(nèi)的生理活性實驗結(jié)果如下:①對小鼠體重、免疫器官和臟器指數(shù)的影響:不同給藥劑量組,對其體重、免疫器官、臟器指數(shù)的影響均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。②對小鼠血清、皮膚組織抗氧化水平和羥脯氨酸含量影響

7、:與D-gal組相比,在25mg/kg和50mg/kg兩個劑量組時,血清中的T-AOC(總抗氧化能力)活性均顯著性增加(P<0.05),SOD(超氧化物歧化酶)的活性在25mg/kg劑量組時有非常顯著性的提高(P<0.01)。不同劑量的海參膠原多肽樣品對小鼠皮膚中的GSH-Px(谷胱甘肽過氧化物酶)、SOD(超氧化物歧化酶)、T-AOC(總抗氧化能力)活性有雙向調(diào)節(jié)作用。與D-gal組相比,在50mg/kg劑量組時,GSH-Px、SOD

8、、T-AOC活性均顯著性提高(P<0.05),尤其是GSH-Px和T-AOC的活性有非常顯著性提高(P<0.01),而在100mg/kg高劑量組時,T-AOC活性有顯著性降低(P<0.05);對皮膚中羥脯氨酸含量的影響無差異顯著性意義(P>0.05)。
　　⒍不同濃度的黒乳海參膠原蛋白多肽樣品對新西蘭兔左心室動脈血體外活化部分凝血活酶時間(APTT)、血漿凝血酶原時間(PT)、凝血酶時間(TT)的影響結(jié)果表明,相對于對照組而言,海

9、參膠原多肽對體外凝血指標(APTT、PT、TT)有雙重調(diào)節(jié)作用。PT在樣品濃度為100.0mg/ml、200.0mg/ml、400.0?g/ml時,與對照組相比均有顯著性縮短(P<0.05);與對照組相比,TT在樣品濃度為100.0mg/ml、200.0mg/ml時,有顯著性縮短(P<0.05);PT和TT在高濃度組800.0mg/ml時,與對照組相比均延長,其中TT有顯著性的延長(P>0.05);APTT在樣品濃度為50.0mg/ml

10、、100.0mg/ml、200.0mg/ml時,與對照組相比均縮短,且有顯著性差異(P<0.05)。而在低濃度組12.5mg/ml、25.0mg/ml時,相對于對照組而言,APTT時間均延長,且在12.5mg/ml時有顯著性延長(P<0.05)。
　　本文首次對黑乳海參膠原蛋白多肽的化學(xué)結(jié)構(gòu)和生物活性進行了研究,采用多種現(xiàn)代層析分離技術(shù)制備純化了大分子膠原蛋白多肽,應(yīng)用 Edman降解和質(zhì)譜方法測定了多肽的氨基酸序列,并進行了多種