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文檔簡介
1、目的
通過以pIRES質(zhì)粒為載體構(gòu)建可同時獨(dú)立表達(dá)Ag85A和ESAT6兩種抗原的抗結(jié)核二價DNA疫苗,并經(jīng)體外實(shí)驗(yàn)評價其免疫原性及免疫效應(yīng),為新型結(jié)核疫苗的研發(fā)提供新的思路和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
方法
1.根據(jù)GenBank報道的目的基因(Ag85A和ESAT6基因)全長序列和pIRES質(zhì)粒酶切位點(diǎn)的特點(diǎn),利用DNAClub及Premier Primer5軟件設(shè)計特異性引物。以結(jié)核桿菌標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv的DNA為模版
2、,經(jīng)PCR擴(kuò)增Ag85A和ESAT6基因,分別用限制性內(nèi)切酶NheⅠ、EcoRⅠ和SalⅠ、EagⅠ對擴(kuò)增產(chǎn)物和pIRES空質(zhì)粒雙酶切,經(jīng)連接酶連接,構(gòu)建pIRES-Ag85A-ESAT6重組質(zhì)粒,并經(jīng)菌液PCR、質(zhì)粒雙酶切和質(zhì)粒測序鑒定。
2.pIRES-Ag85A-ESAT6重組質(zhì)粒鑒定構(gòu)建成功后,轉(zhuǎn)入DH5α菌株,篩選重組質(zhì)粒,并用質(zhì)粒小提試劑盒分離純化質(zhì)粒DNA。
3.將重組質(zhì)粒采用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染至RAW264
3、.7細(xì)胞,于5% CO2培養(yǎng)箱中,37℃,培養(yǎng)24~48h后,western blot法檢測質(zhì)粒蛋白表達(dá)情況。
4.大量提取重組質(zhì)粒,經(jīng)三次肌肉注射質(zhì)粒免疫BALB/c小鼠,每次間隔2w,末次免疫2w后,取小鼠血清,用ELISA法檢測血清中抗Ag85A抗體和抗ESAT6抗體情況。
5.同時無菌取小鼠脾細(xì)胞在Ag85A和ESAT6蛋白刺激下培養(yǎng),用ELISA法檢測培養(yǎng)液中細(xì)胞因子(IFN-γ、IL-2、IL-4)分泌情
4、況。
結(jié)果
1.成功構(gòu)建pIRES-Ag85A-ESAT6重組質(zhì)粒,經(jīng)PCR鑒定、質(zhì)粒雙酶切,DNA凝膠電泳后,分別出現(xiàn)1017bp和288bp的條帶,與Ag85A和ESAT6的理論值相符,并經(jīng)測序進(jìn)一步鑒定構(gòu)建成功。
2.分別將用三種濃度的pIRES-Ag85A-ESAT6重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至RAW264.7細(xì)胞后,經(jīng)western blot鑒定證實(shí)了Ag85A和ESAT6兩種蛋白可在細(xì)胞內(nèi)成功表達(dá),且表達(dá)水平
5、與轉(zhuǎn)染劑量存在正相關(guān)。
3.ELISA法檢測免疫小鼠血清中抗Ag85A抗體和抗ESAT6抗體變化情況,發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染了pIRES-Ag85A-ESAT6質(zhì)粒的二價疫苗組,相應(yīng)的抗Ag85A抗體和抗ESAT6抗體明顯升高,(P<0.05),且IgG2a抗體升高明顯。
4.在細(xì)胞因子檢測中,pIRES-Ag85A-ESAT6質(zhì)粒組的IFN-γ、 IL-2水平顯著升高(P<0.05),而IL-4的值均較低,組間無顯著差異性。
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