pIRES-Ag85A-ESAT6抗結(jié)核二價(jià)DNA疫苗的構(gòu)建及其免疫效應(yīng)研究.pdf

1、目的
　　通過以pIRES質(zhì)粒為載體構(gòu)建可同時(shí)獨(dú)立表達(dá)Ag85A和ESAT6兩種抗原的抗結(jié)核二價(jià)DNA疫苗，并經(jīng)體外實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)其免疫原性及免疫效應(yīng)，為新型結(jié)核疫苗的研發(fā)提供新的思路和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　方法
　　1.根據(jù)GenBank報(bào)道的目的基因（Ag85A和ESAT6基因）全長序列和pIRES質(zhì)粒酶切位點(diǎn)的特點(diǎn)，利用DNAClub及Premier Primer5軟件設(shè)計(jì)特異性引物。以結(jié)核桿菌標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv的DNA為模版

2、，經(jīng)PCR擴(kuò)增Ag85A和ESAT6基因，分別用限制性內(nèi)切酶NheⅠ、EcoRⅠ和SalⅠ、EagⅠ對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物和pIRES空質(zhì)粒雙酶切，經(jīng)連接酶連接，構(gòu)建pIRES-Ag85A-ESAT6重組質(zhì)粒，并經(jīng)菌液PCR、質(zhì)粒雙酶切和質(zhì)粒測(cè)序鑒定。
　　2.pIRES-Ag85A-ESAT6重組質(zhì)粒鑒定構(gòu)建成功后，轉(zhuǎn)入DH5α菌株，篩選重組質(zhì)粒，并用質(zhì)粒小提試劑盒分離純化質(zhì)粒DNA。
　　3.將重組質(zhì)粒采用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染至RAW264

3、.7細(xì)胞，于5％ CO2培養(yǎng)箱中，37℃，培養(yǎng)24～48h后，western blot法檢測(cè)質(zhì)粒蛋白表達(dá)情況。
　　4.大量提取重組質(zhì)粒，經(jīng)三次肌肉注射質(zhì)粒免疫BALB/c小鼠，每次間隔2w，末次免疫2w后，取小鼠血清，用ELISA法檢測(cè)血清中抗Ag85A抗體和抗ESAT6抗體情況。
　　5.同時(shí)無菌取小鼠脾細(xì)胞在Ag85A和ESAT6蛋白刺激下培養(yǎng)，用ELISA法檢測(cè)培養(yǎng)液中細(xì)胞因子（IFN-γ、IL-2、IL-4）分泌情

4、況。
　　結(jié)果
　　1.成功構(gòu)建pIRES-Ag85A-ESAT6重組質(zhì)粒，經(jīng)PCR鑒定、質(zhì)粒雙酶切，DNA凝膠電泳后，分別出現(xiàn)1017bp和288bp的條帶，與Ag85A和ESAT6的理論值相符，并經(jīng)測(cè)序進(jìn)一步鑒定構(gòu)建成功。
　　2.分別將用三種濃度的pIRES-Ag85A-ESAT6重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至RAW264.7細(xì)胞后，經(jīng)western blot鑒定證實(shí)了Ag85A和ESAT6兩種蛋白可在細(xì)胞內(nèi)成功表達(dá)，且表達(dá)水平

5、與轉(zhuǎn)染劑量存在正相關(guān)。
　　3.ELISA法檢測(cè)免疫小鼠血清中抗Ag85A抗體和抗ESAT6抗體變化情況，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染了pIRES-Ag85A-ESAT6質(zhì)粒的二價(jià)疫苗組，相應(yīng)的抗Ag85A抗體和抗ESAT6抗體明顯升高，(P＜0.05)，且IgG2a抗體升高明顯。
　　4.在細(xì)胞因子檢測(cè)中，pIRES-Ag85A-ESAT6質(zhì)粒組的IFN-γ、 IL-2水平顯著升高(P＜0.05)，而IL-4的值均較低，組間無顯著差異性。