滬杭地區(qū)番茄上黃瓜花葉病毒基因多態(tài)性的研究.pdf

1、番茄病毒病是危害我國(guó)番茄產(chǎn)量與質(zhì)量的主要原因,導(dǎo)致我國(guó)番茄病毒病的主要病毒為黃瓜花葉病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)和番茄花葉病毒(Tomato mosaic virus,ToMV),二者可以單獨(dú)侵染也可以復(fù)合侵染。番茄病毒病的發(fā)生與病毒種類、地域和季節(jié)具有相關(guān)性。夏秋兩季為番茄病毒病的高發(fā)季節(jié),本研究于滬杭地區(qū)不同地點(diǎn)采集具有差異性癥狀的田間番茄樣品,檢測(cè)侵染該地區(qū)番茄的病毒,并對(duì)主要毒源CMV作詳細(xì)分類與研

2、究。本文利用多重RT-PCR方法和DAS-ELISA檢測(cè)侵染番茄的病毒,并對(duì)主要毒源CMV進(jìn)行酶切圖譜差異性分析,進(jìn)而應(yīng)用dsRNA-SPAT方法對(duì)幾類典型CMV分離物克隆測(cè)序并進(jìn)行序列分析。
　　 受病毒侵染的田間番茄主要癥狀分為四類:重花葉、線性葉、輕花葉和葉片卷曲。本文采集具有上述癥狀的番茄樣品,應(yīng)用DAS-ELISA方法檢測(cè)CMV、ToMV、TMV、TAY、PVX、PVY、ToRSV和TSWV等。并且運(yùn)用以植物18SrR

3、NA為內(nèi)參的多重RT-PCR方法,同時(shí)檢測(cè)CMVⅠ、CMVⅡ及CMV攜帶的sat RNA,以及TMV和ToMV等病毒,實(shí)現(xiàn)了屬間檢測(cè)。結(jié)果表明侵染該地區(qū)田間番茄的主要毒源為CMV和ToMV,且存在復(fù)合侵染現(xiàn)象。CMV所占比例大于ToMV,CMV亞組Ⅰ占主要地位,同時(shí)檢測(cè)到攜帶satRNA的CMV樣品。通過與DAS-ELISA檢測(cè)結(jié)果及靈敏性試驗(yàn)比較,說明多重RT-PCR為一種靈敏性高,準(zhǔn)確度好的檢測(cè)方法。
　　 將檢測(cè)到CMV的

4、番茄樣品轉(zhuǎn)接心葉煙與合作903番茄,培養(yǎng)于溫室保存毒源。根據(jù)癥狀差異和多重。RT-PCR檢測(cè)結(jié)果,根據(jù)RNA3類別選取5個(gè)CMV亞組Ⅰ和1個(gè)CMV亞組Ⅱ樣品進(jìn)行基于RT-PCR的限制性酶切分析。該方法不僅可以鑒定CMV亞組Ⅰ和亞組Ⅱ株系之間的復(fù)合侵染,也可以對(duì)不同CMV株系的三條基因組RNA鏈進(jìn)行快速分組鑒定,檢測(cè)是否存在天然假重組現(xiàn)象。酶切結(jié)果顯示:5個(gè)CMV亞組Ⅰ樣品中,RNA1和RNA2均與CMV亞組Ⅰ標(biāo)準(zhǔn)株系酶切結(jié)果相同,sc3

5、,sc7,xs15的RNA3與CMV亞組ⅠB、xs11的RNA3與CMV亞組ⅠA的酶切結(jié)果一致,但是sc20的RNA3片段酶切后沒有變化,推測(cè)sc20的RNA3上限制性酶MspⅠ作用位點(diǎn)發(fā)生了變化;CMV亞組Ⅱ樣品的3條基因組片段酶切結(jié)果均與CMV亞組Ⅱ標(biāo)準(zhǔn)株系一致。限制性酶切分析結(jié)果表明樣品中沒有假重組現(xiàn)象存在。
　　 用于限制性酶切分析的樣品轉(zhuǎn)接合作903番茄后提取dsRNA,通過單引物擴(kuò)增法(SPAT)獲得擴(kuò)增片段,克隆測(cè)

6、序獲得樣品RNA3的全長(zhǎng)序列。同源性結(jié)果顯示,樣品xs11的RNA3與其他四個(gè)CMV亞組Ⅰ樣品相比,與CMV亞組ⅠA具有較高的同源性,xs16的RNA3與CMV亞組Ⅱ同源性較高。進(jìn)化樹分析結(jié)果與同源性比對(duì)結(jié)果基本一致。序列分析及酶切位點(diǎn)比對(duì)結(jié)果顯示,sc20 RNA3的CP基因在MspⅠ作用位點(diǎn)發(fā)生點(diǎn)突變,喪失了酶切位點(diǎn),因此sc20的RNA3經(jīng)MspⅠ作用后片段沒有發(fā)生變化,與推測(cè)一致。
　　 綜上所述,侵染滬杭地區(qū)田間番茄的