HFRS患者漢灘病毒特異性T淋巴細(xì)胞克隆的建立及核衣殼蛋白C-端T細(xì)胞表位初步鑒定.pdf

1、該課題取材于中國疫區(qū)HFRS患者,應(yīng)用ELISPOT實(shí)驗(yàn),并結(jié)合傳統(tǒng)的T細(xì)胞克隆、T細(xì)胞增殖和基因轉(zhuǎn)染等技術(shù),自HFRS患者外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)建立HTNV特異性CD8+T淋巴細(xì)胞克隆和B淋巴母細(xì)胞系(B-LCL),篩選出能夠引起特異性細(xì)胞毒殺傷效應(yīng)的優(yōu)勢(shì)T細(xì)胞表位,為揭示HFRS免疫應(yīng)答和免疫防護(hù)的分子基礎(chǔ)、闡明HFRS的發(fā)病機(jī)理和研制新型疫苗提供重要資料.主要實(shí)驗(yàn)內(nèi)容和結(jié)果如下:1采用Ficoll密度梯度離心法,分離HFRS

2、患者的外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC),并用EBV轉(zhuǎn)化HFRS患者PBMC中的B淋巴細(xì)胞,建立了B淋巴母細(xì)胞系(B-LCL).2用含HTNV S基因的重組痘苗病毒(rVV)轉(zhuǎn)染B-LCL,并用IFA和Western blot(WB)檢測(cè)核衣殼蛋白(NP)在B-LCL中的表達(dá).結(jié)果表明,在B-LCL中能有效表達(dá)NP.3表達(dá)NP的B-LCL在細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)中能被T細(xì)胞克隆識(shí)別.表明rVV轉(zhuǎn)染B-LCL可作為細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞(CTL)反應(yīng)的靶細(xì)胞.4

3、采用有限稀釋法,自1名HFRS患者(供體4)建立了2株以CD8+T細(xì)胞為主的克隆(4-B,4-C).5合成覆蓋HTNV代表株(76-118株)NP C-端(aa 283~429)的重迭系列短肽庫(共計(jì)23條重迭9個(gè)aa的1 5肽系列短肽).應(yīng)用ELISPOT技術(shù)和T細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn),觀察了HFRS患者PBMC中的T淋巴細(xì)胞對(duì)HTNV NP合成肽段的免疫學(xué)反應(yīng),初步篩檢T細(xì)胞表位.結(jié)果表明,No.51肽(aa 301~315),No.60肽(