急性乙型肝炎患者HBV特異性CD8+T淋巴細(xì)胞受體α和β鏈取用的研究.pdf

1、全球有超過3.5億HBV慢性感染患者,乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)感染可引起急慢性肝炎,肝硬化及肝細(xì)胞癌等,嚴(yán)重危害著人類的健康。雖然乙型肝炎的發(fā)病機(jī)制仍不完全清楚,病毒的清除涉及到很多因素,如機(jī)體本身,病毒,以及機(jī)體免疫反應(yīng)應(yīng)答能力等,但目前研究比較一致認(rèn)為,HBV是非直接致細(xì)胞病變病毒,它自身并不引起肝細(xì)胞損害,肝臟的損傷是由免疫應(yīng)答反應(yīng)所致,其中特異性CD8+T淋巴細(xì)胞即特異性細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞(cy

2、totoxic T lymphocytes,CTL)免疫應(yīng)答反應(yīng)在清除病毒和決定疾病轉(zhuǎn)歸中發(fā)揮重要作用。急性乙型肝炎患者體內(nèi)存在較強(qiáng)的多特異性CTL反應(yīng),對清除感染病毒發(fā)揮關(guān)鍵作用,同時也與免疫病理損傷的程度和類型密切相關(guān);而慢性乙型肝炎患者的外周血中往往CTL反應(yīng)很弱或針對的病毒抗原表位單一,是HBV不能被及時清除的重要因素。引起這種HBV特異性CTL反應(yīng)差異的分子機(jī)制目前尚不完全清楚。由于CTL的特異性取決于細(xì)胞表面的T細(xì)胞受體(T

3、 cell receptor,TCR),而TCR的特性主要決定于a和b鏈可變區(qū)(V區(qū))的分子組成,因此,揭示特異性CD8+T細(xì)胞的TCR分子的組成特性十分重要。本研究的目標(biāo)是分析急性乙肝患者HBV抗原表位特異性CD8+T細(xì)胞TCRa和b鏈的取用特點(diǎn),幫助闡明急性乙型肝炎患者特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答的特點(diǎn)及其分子機(jī)制,同時獲取特異性CD8+T細(xì)胞TCRa和b鏈可變區(qū)的序列信息,幫助闡明HBV的免疫致病和免疫清除機(jī)理,并為乙型肝炎的免疫治療提供支

4、持。
　　目的: 1.建立一種高效擴(kuò)增人T細(xì)胞受體(TCR)α和β鏈可變區(qū)基因的方法。
　　2.分析急性乙型肝炎患者外周血中HBV特異性CD8+T細(xì)胞的頻率。
　　3.分析急性乙型肝炎患者HBV特異性CD8+T細(xì)胞受體Vα和Vβ亞家族特點(diǎn)。
　　方法: 1.根據(jù)32個TCR Vα和25個TCR Vβ亞家族基因序列特點(diǎn),分別設(shè)計(jì)Vα基因的上游內(nèi)、外引物各42條以及Vβ基因的上游內(nèi)引物34條、上游外引物37條。在α鏈

5、以及β鏈的恒定區(qū)(C區(qū))設(shè)計(jì)下游內(nèi)、外引物和測序引物各1條以及擴(kuò)增Cα和Cβ基因的上游引物各1條。提取正常人CD8T細(xì)胞的 RNA,用 PolyA介導(dǎo)反轉(zhuǎn)錄后,采用巢式 PCR擴(kuò)增正常人CD8 T細(xì)胞32個Vα和25個Vβ亞家族基因,并用Jurkat T淋巴瘤細(xì)胞作為對照。用T-easy載體克隆PCR產(chǎn)物,對克隆基因進(jìn)行測序。
　　2.運(yùn)用MHC肽五聚體法結(jié)合流式細(xì)胞技術(shù)檢測急性和慢性乙型肝炎患者外周血HBsAg335-343和H

6、BsAg183-191抗原表位特異性CD8+ T細(xì)胞頻率;同時分析急性乙型肝炎患者特異性 CD8+ T細(xì)胞的頻率分別與血清ALT水平及病毒載量之間的關(guān)系;動態(tài)分析急性乙型肝炎患者外周血的HBsAg335-343特異性CD8+T細(xì)胞的頻率變化。
　　3.從3例HLA*0201急性乙型肝炎患者的外周血分離外周血單個核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMC),用HBsAg S335-343抗

7、原表位多肽和細(xì)胞因子刺激PBMC以誘導(dǎo)抗原表位特異性CD8+ T細(xì)胞的增殖,用流式細(xì)胞儀分選特異性CD8+ T細(xì)胞到96孔培養(yǎng)板,培養(yǎng)10~14 d后,提取細(xì)胞的RNA,PolyA介導(dǎo)反轉(zhuǎn)錄,巢式PCR擴(kuò)增TCR Vα和Vβ,并用3例患者的非特異性CD8+T細(xì)胞作為對照。對擴(kuò)增產(chǎn)物分別進(jìn)行直接測序和克隆測序分析。
　　結(jié)果: 1.從正常人的CD8 T細(xì)胞中擴(kuò)增到所有TCR Vα和Vβ亞家族基因,克隆后測序與相應(yīng)的參考序列同源。從

8、Jurkat細(xì)胞擴(kuò)增出 TCR Vα1和Vβ8基因,經(jīng)測序驗(yàn)證與文獻(xiàn)報道一致,且最少可從10個細(xì)胞提取的RNA模板中擴(kuò)增成功。
　　2.急性乙型肝炎患者的HBsAg335-343特異性CD8+ T細(xì)胞的陽性率為0.45％±0.52%,HBsAg183-191特異性 CD8+ T細(xì)胞陽性率為0.19%±0.22%。慢性乙型肝炎患者的HBsAg335-343特異性CD8+ T細(xì)胞陽性率為0.05%±0.04%,HBsAg183-191

9、特異性CD8+T細(xì)胞陽性率為0.08%±0.10%。比較急性期患者,HBsAg335-343特異性CD8+T細(xì)胞陽性率與血清ALT水平及病毒載量的相關(guān)性分析得出 P值均大于0.05,無顯著相關(guān)性;HBsAg183-191特異性CD8+T細(xì)胞陽性率與血清ALT水平及病毒載量的相關(guān)性分析得出 P值均大于0.05,無顯著相關(guān)性。然而在恢復(fù)期, HBsAg335-343特異性CD8+T細(xì)胞的陽性率明顯下降。
　　3.3例急性乙型肝炎患者的

10、HBsAg335-343表位特異性CD8+T細(xì)胞表達(dá)的TCR Vα和Vβ亞家族基因的種類和數(shù)目都各不同,但是均優(yōu)勢表達(dá)了Vα2、Vα3、Vα15、Vα20亞家族基因以及Vβ2、Vβ3、Vβ5、Vβ7、Vβ13、Vβ14、Vβ16亞家族基因。序列比對結(jié)果得知3例患者的 HBsAg335-343表位特異性CD8+T細(xì)胞的TCR的 CDR3具有不同的長度和序列。
　　結(jié)論: 1.建立了一種高效靈敏的TCRα和β鏈可變區(qū)基因的擴(kuò)增方法,為

11、抗原特異性CD8+T細(xì)胞TCR克隆和譜系利用研究提供了技術(shù)支持。
　　2.發(fā)現(xiàn)了急性乙型肝炎患者HBV特異性CD8+T細(xì)胞TCR存在優(yōu)勢利用的特點(diǎn),并提示TCR優(yōu)勢利用是由于針對同一抗原的特異性CD8+T細(xì)胞克隆性增殖所致,這一發(fā)現(xiàn)為抗病毒CTL應(yīng)答中TCR優(yōu)勢利用對病毒清除有利的假說提供了新的支持證據(jù)。
　　3.首次克隆了中國乙型肝炎患者HBV特異性CD8+T細(xì)胞優(yōu)勢TCRa和b鏈編碼基因,為TCR轉(zhuǎn)基因表達(dá)進(jìn)行特異性CT