斑馬魚模型用于沙門菌質(zhì)粒毒力基因spv對(duì)機(jī)體感染與免疫功能影響的研究.pdf

1、目的：
　　斑馬魚作為一種重要的脊椎動(dòng)物，憑借體型小、生命周期短和繁殖量大等特點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于多種疾病模型的研究。斑馬魚受精后48 h，中性粒細(xì)胞即發(fā)揮作用；72 h至3w的斑馬魚幼魚階段處于只有固有免疫的特殊時(shí)期。斑馬魚免疫系統(tǒng)的發(fā)育與成熟過程與人類極為相似，且基因組與人類高度同源，成魚既有固有免疫又有適應(yīng)性免疫，是研究機(jī)體病原生物感染后免疫應(yīng)答很好的模式生物。
　　為研究沙門菌質(zhì)粒毒力基因（Salmonellaplasmi

2、d virulence genes，spv）對(duì)機(jī)體感染與免疫的影響，本研究用鼠傷寒沙門菌（Salmonella entericaserovar typhimurium，S.typhimurium，STM）野生株 STM-WT和缺失 spv基因的突變株STM-Δspv，第一部分用受精后72 h只有固有免疫的斑馬魚幼魚模型，探討該基因?qū)C(jī)體感染與固有免疫功能的影響；第二部分建立8月齡具有適應(yīng)性免疫的成魚感染模型，探討spv基因?qū)C(jī)體感染及T

3、h1/Th2免疫應(yīng)答的影響，為進(jìn)一步闡明沙門菌質(zhì)粒毒力基因spv的致病機(jī)制和對(duì)機(jī)體免疫功能的影響提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法：
　　1.沙門菌質(zhì)粒毒力基因spv對(duì)幼魚感染及固有免疫功能的影響
　　(1)沙門菌在斑馬魚幼魚體內(nèi)的播散
　　斑馬魚感染按本實(shí)驗(yàn)室已建立的幼魚感染模型方法進(jìn)行，用紅色熒光蛋白（red fluorescent protein，RFP）標(biāo)記的鼠傷寒沙門菌野生株STM-WT和突變株STM-Δs

4、pv，浸染受精后72 h（hours post-fertilization，hpf）的斑馬魚幼魚，為STM-WT組和STM-Δspv組，每組30條，感染后2、4和8 h分別取10條用熒光顯微鏡觀察細(xì)菌在體內(nèi)的播散情況。
　　(2)沙門菌質(zhì)粒毒力基因spv對(duì)中性粒細(xì)胞募集的影響
　　用鼠傷寒沙門菌野生株STM-WT和突變株STM-Δspv感染72 hpf斑馬魚幼魚，以上兩感染組每組30條，另設(shè)對(duì)照組10條魚，收集對(duì)照組和感染后

5、2、4和8h各10條斑馬魚，固定后用可對(duì)中性粒細(xì)胞顆粒進(jìn)行著色的蘇丹黑染色，顯微鏡觀察中性粒細(xì)胞募集情況。
　　(3)沙門菌質(zhì)粒毒力基因spv對(duì)巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響
　　設(shè)對(duì)照組、STM-WT和STM-Δspv感染后2、4和8 h組，每組10條，在72 hpf斑馬魚培養(yǎng)液中加入中性紅染液，根據(jù)感染后巨噬細(xì)胞吞噬染料程度判斷細(xì)胞功能。于不同時(shí)間點(diǎn)加入鼠傷寒沙門菌野生株STM-WT和突變株STM-Δspv使其分別浸染2、4和8

6、h，將幼魚麻醉后置顯微鏡下觀察巨噬細(xì)胞著色情況。
　　(4)沙門菌質(zhì)粒毒力基因spv對(duì)巨噬細(xì)胞吞噬后細(xì)菌存活的影響
　　用鼠傷寒沙門菌野生株STM-WT和突變株STM-Δspv感染72 hpf幼魚，每感染組40條魚，另設(shè)對(duì)照組10條，收集對(duì)照組及感染后2、4、8和12h各10條斑馬魚，分離巨噬細(xì)胞后進(jìn)行胞內(nèi)菌落計(jì)數(shù)（colony-forming unit，CFU）。
　　2.沙門菌質(zhì)粒毒力基因spv對(duì)成魚感染及Th1/

7、Th2免疫應(yīng)答的影響
　　(1)沙門菌-斑馬魚成魚感染模型的建立
　　用103、104、105、106和107 CFU鼠傷寒沙門菌野生株STM-WT口飼感染8月齡的成魚，每組10條，觀察各劑量下對(duì)成魚的存活及感染情況，繪制3周生存率曲線。用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Real-time Quantitative PCR，qPCR）檢測肝臟Th1型細(xì)胞特異性T-box家族的新型轉(zhuǎn)錄因子（T-box factor express

8、ed in T-cells，T-bet，亦稱TBX21）基因tbx21和Th2細(xì)胞特異性的轉(zhuǎn)錄因子GATA結(jié)合蛋白3（GATA binding protein3，GATA-3）基因gata3mRNA轉(zhuǎn)錄水平；Th1型細(xì)胞因子γ干擾素（Interferon-γ，IFN-γ）、白介素12（interleukin-12，IL-12）和腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）基因IFN-γ、IL-12和TNF

9、-α以及Th2型細(xì)胞因子IL-4、IL-10和IL-13基因IL-4、IL-10和IL-13的mRNA轉(zhuǎn)錄水平，計(jì)算Th2/Th1相對(duì)表達(dá)量比值并確定用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)的合適感染菌量。
　　(2)沙門菌質(zhì)粒毒力基因spv對(duì)斑馬魚成魚感染的影響
　　用上述條件建立的成魚感染模型，設(shè)對(duì)照組、STM-WT和STM-Δspv組，以105CFUSTM-WT和STM-Δspv口飼后1d、7 d和14 d，每時(shí)間點(diǎn)取5條魚，解剖取出肝臟和腸道。

10、分別進(jìn)行CFU、蘇木精-伊紅染色（hematoxylin-eosin staining，HE染色）后光鏡下觀察和透射電鏡（transmission electron microscope，TEM）觀察腸道超微結(jié)構(gòu)變化。
　　(3)沙門菌質(zhì)粒毒力基因spv對(duì)Th1/Th2免疫應(yīng)答的影響
　　設(shè)對(duì)照組、STM-WT和STM-Δspv組，用STM-WT和STM-Δspv口飼后7 d、14 d，每時(shí)間點(diǎn)取5條魚，取出斑馬魚肝臟和腸道

11、，提取組織RNA，qPCR檢測tbx21、gata3以及Th1型細(xì)胞因子基因IFN-γ、IL-12和TNF-α，Th2型細(xì)胞因子基因IL-4、IL-10和IL-13的mRNA轉(zhuǎn)錄水平，為顯示 Th1/Th2免疫偏移，計(jì)算 gata3/tbx21和IL-4/IFN-γ的相對(duì)表達(dá)量比值。同時(shí)用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）法檢測Th1型細(xì)胞因子IFN-γ、IL-12和TNF

12、-α，Th2型細(xì)胞因子IL-4、IL-10和IL-13的含量。
　　結(jié)果：
　　1.沙門菌質(zhì)粒毒力基因spv對(duì)幼魚感染及固有免疫功能的影響
　　(1)沙門菌在斑馬魚幼魚體內(nèi)的播散：
　　熒光顯微鏡下觀察結(jié)果顯示，感染后2h兩組斑馬魚體內(nèi)均有少量帶有紅色熒光的細(xì)菌播散，組間未見差異；感染后4 h紅色熒光標(biāo)記的野生株STM-WT組（RFP-STM-WT）頭部及卵黃囊部位有較明顯的紅色點(diǎn)狀聚集，而突變株STM-Δspv

13、組（RFP-STM-Δspv）只有少量紅色點(diǎn)狀；感染后8 hRFP-STM-WT組口周出現(xiàn)大量的紅色細(xì)菌聚集。
　　(2)沙門菌質(zhì)粒毒力基因spv對(duì)中性粒細(xì)胞募集的影響
　　感染前未見中性粒細(xì)胞聚集的黑色顆粒；感染后隨著時(shí)間的延長，黑色顆粒增多；感染后4 h和8 hSTM-Δspv組的黑色顆粒均顯著多于STM-WT組（P<0.05）。
　　(3)沙門菌質(zhì)粒毒力基因spv對(duì)巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響
　　感染前未見明顯

14、的紅色點(diǎn)狀聚集；從感染后2 h到8 h，可見越來越多的紅色點(diǎn)狀聚集；感染后2、4和8 h三個(gè)時(shí)間點(diǎn)STM-WT組紅色點(diǎn)狀聚集均少于STM-Δspv組，感染后8 h最為顯著（P<0.05）。
　　(4)沙門菌質(zhì)粒毒力基因spv對(duì)巨噬細(xì)胞內(nèi)菌落計(jì)數(shù)的影響
　　胞內(nèi)CFU計(jì)數(shù)結(jié)果顯示，菌量隨著感染時(shí)間的延長遞增，感染后4h、8 h和12 hSTM-WT組CFU均顯著高于STM-Δspv組（P<0.05）。
　　2.沙門菌質(zhì)粒

15、毒力基因spv對(duì)成魚感染及Th1/Th2免疫應(yīng)答的影響
　　(1)沙門菌-斑馬魚成魚感染模型的建立
　　用105 CFU感染2周后斑馬魚全部存活，第15天開始出現(xiàn)死亡，在3周后死亡率達(dá)50％；感染后3周解剖發(fā)現(xiàn)，肝臟、脾臟和腸道有明顯紅腫和糜爛；肝臟Th1和Th2型細(xì)胞相關(guān)基因和細(xì)胞因子mRNA轉(zhuǎn)錄水平明顯向Th2偏移。
　　(2)沙門菌質(zhì)粒毒力基因spv對(duì)成魚感染的影響
　　臟器組織CFU結(jié)果顯示，隨著感染時(shí)間

16、增加，肝臟和腸道細(xì)菌量均增多，但STM-WT組均顯著高于STM-Δspv組（P<0.05）。肝臟HE染色見隨感染時(shí)間增加，STM-WT組肝臟有大量空泡變性，且局部有炎性細(xì)胞浸潤；STM-Δspv組感染后1 d和7 d肝臟組織未見空泡變性，感染后14 d出現(xiàn)空泡變性，但少有炎性細(xì)胞浸潤。腸組織HE染色見STM-WT組中隨時(shí)間增加腸壁變薄，腸上皮微絨毛排列不整，并有炎性細(xì)胞浸潤。STM-Δspv組在感染后1 d和7 d腸壁厚度未見明顯改變，

17、微絨毛排列較整齊，感染后14 d出現(xiàn)輕微紊亂。
　　透射電鏡下見未感染的斑馬魚對(duì)照組，腸上皮排列整齊，細(xì)胞界限清晰，游離面有緊密整齊的微絨毛；STM-WT組感染后1 d可見腸道微絨毛斷裂，上皮細(xì)胞形態(tài)未見明顯改變；感染后7d細(xì)胞界限模糊，腸腔和細(xì)胞內(nèi)均見有細(xì)菌分布；STM-Δspv組感染后1 d與對(duì)照組無明顯差別，感染后7 d微絨毛有輕微斷裂，細(xì)胞結(jié)構(gòu)也有改變。
　　(3)沙門菌質(zhì)粒毒力基因spv對(duì)Th1/Th2免疫應(yīng)答的影

18、響：
　　qPCR檢測結(jié)果顯示STM-WT組感染后14 d，肝臟和腸道中g(shù)ata3/tbx21和IL-4/IFN-γ的相對(duì)表達(dá)比值均顯著上升（P<0.05）；在感染后14 d，STM-WT組IL-12和TNF-α的表達(dá)水平顯著低于STM-Δspv組，IL-10和IL-13的表達(dá)水平顯著高于STM-Δspv組（P<0.05）。ELISA檢測結(jié)果顯示，感染7 d和14 d后，肝臟和腸道中STM-WT組IFN-γ含量均顯著低于STM-Δ

19、spv組（P<0.05）；感染后14 d，STM-WT組IL-12和TNF-α的含量顯著低于STM-Δspv組，IL-4和IL-10的含量STM-WT組顯著高于STM-Δspv組（P<0.05）；肝臟中IL-13的含量未見明顯差異，但在腸道中感染7 d和14 d后，STM-WT組均顯著高于STM-Δspv組（P<0.05）。
　　結(jié)論：
　　1．沙門菌質(zhì)粒毒力基因spv通過抑制中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞向炎癥部位的趨化、聚集及吞噬

20、殺傷，利于病原菌逃逸機(jī)體的固有免疫反應(yīng)，從而促進(jìn)細(xì)菌在體內(nèi)的播散加重感染。
　　2．構(gòu)建的沙門菌-斑馬魚成魚感染模型，能反映機(jī)體感染和免疫功能的變化，可用于研究適應(yīng)性免疫 Th1/Th2免疫應(yīng)答，為進(jìn)一步研究鼠傷寒沙門菌感染與免疫機(jī)制提供了很好的實(shí)驗(yàn)工具。
　　3．沙門菌質(zhì)粒毒力基因spv通過抑制Th1型細(xì)胞基因tbx21的轉(zhuǎn)錄和細(xì)胞因子IFN-γ、IL-12和TNF-α的表達(dá)，促進(jìn)Th2型細(xì)胞基因gata3的轉(zhuǎn)錄和細(xì)胞因子