cAMP受體蛋白調(diào)控鼠疫耶爾森氏菌毒力的研究.pdf

1、鼠疫的病原菌是鼠疫耶爾森氏菌(以下簡稱鼠疫菌)，在自然界，鼠疫的主要宿主是嚙齒動物，主要通過節(jié)肢動物蚤的叮咬在宿主之間傳播。通過蚤叮咬或者其它途徑，鼠疫可以傳染給人，引發(fā)腺鼠疫、肺鼠疫和敗血癥鼠疫。 鼠疫菌從鼠蚤傳播到新的宿主過程中，經(jīng)歷了溫度，滲透壓，離子濃度，PH，氧等信號的改變，鼠疫菌必須適應(yīng)相應(yīng)的環(huán)境壓力才能存活并維持其毒力和致病性，而每個適應(yīng)性反應(yīng)也必然伴隨著鼠疫菌基因轉(zhuǎn)錄的改變，這體現(xiàn)在：很多特定的調(diào)控子，分別感應(yīng)特

2、定的外界信號，介導(dǎo)特定基因(包括毒力基因)表達(dá)的上調(diào)和下調(diào)，最終組成復(fù)雜的毒力調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，控制鼠疫菌在媒介和貯存宿主中生存能力和致病力。 cAMP受體蛋白(cAMP receptor protein，CRP)作為細(xì)菌調(diào)控子能調(diào)控E.coli的100多個基因，包括參與分解代謝抑制的基因。在本實驗中，構(gòu)建了鼠疫菌201株的crp突變株(△crp)和回復(fù)株。通過體內(nèi)外的毒力表型實驗證實了CRP的毒力調(diào)控表型。利用比較芯片表達(dá)譜分析生長在

3、TMH—1mMcAMP中的鼠疫菌201株和△crp的差異表達(dá)基因，根據(jù)E.coli CRP的基序的特點，用生物信息學(xué)的方法預(yù)測可能受CRP直接調(diào)控的靶基因38個，進(jìn)一步用實時定量RT-PCR和EMSA(凝膠阻滯實驗)來驗證確定CRP的最小調(diào)控元。在此基礎(chǔ)上，選取水平轉(zhuǎn)移獲得的毒力相關(guān)的質(zhì)?；騪la，pst和操縱子sycO—ypkA—yopJ進(jìn)行精細(xì)調(diào)控機(jī)制的研究。通過體內(nèi)的LacZ報告基因融合實驗證明CRP對pla，pst和ypkA有

4、直接調(diào)控作用，然后分別用引物延伸實驗(Primer extension assay)和DNaseⅠ足跡實驗(DNaseⅠfootprinting assay)確定上述毒力基因啟動子區(qū)的轉(zhuǎn)錄起始位點，核心啟動子元件和CRP結(jié)合位點序列，揭示上述基因的啟動子區(qū)的結(jié)構(gòu)圖。 表型實驗顯示crp的突變在體內(nèi)和體外均影響突變株的生長，體外的生長曲線顯示△crp的倍增時間長于WT，體內(nèi)實驗證明皮下途徑感染時突變株的毒力比相應(yīng)的野生株下降了15

5、，000多倍，而靜脈途徑感染時，突變株的毒力大約下降了40倍。因此CRP是鼠疫菌毒力所必須的，并且在皮下感染途徑中更重要。體內(nèi)實驗證實crp突變株的生長減慢可能是導(dǎo)致兩種感染途徑中突變株毒力減弱的部分原因。而相應(yīng)的回復(fù)株能恢復(fù)crp缺失株的毒力表型，達(dá)到與野生株的毒力表型一致的水平。先前的實驗證明由Pla編碼的纖維蛋白酶原激活劑能特異性的促進(jìn)鼠疫菌從外周感染部位(皮下感染[跳蚤叮咬]或者吸入)擴(kuò)散。以上的實驗證據(jù)都說明crp突變株中pl

6、a的表達(dá)缺失除了能降低體內(nèi)的生長表型外，還能大大降低該突變株在皮下感染途徑中的毒力。 在本實驗中，用鼠疫全基因組芯片采用雙色熒光的比較芯片表達(dá)譜實驗分析生長在TMH—1mMcAMP中的鼠疫菌田鼠型的野生株和△crp，篩選出278個差異表達(dá)基因，其中△crp相比于野生株(WT)，有104個基因表達(dá)上調(diào)，174個下調(diào)。 匯總E.coli CRP結(jié)合位點，用consensus—matrix和convert—matrix程序計算

7、CRP結(jié)合序列每個位置四個堿基出現(xiàn)的權(quán)重，得到CRP結(jié)合序列的Matrix，進(jìn)而用WebLogo軟件展示序列l(wèi)ogo，最終預(yù)測得到CRP結(jié)合box：TGTGA—N6-TCTCA。利用Matrix scan程序查找278個差異表達(dá)基因中的保守CRP基序，找到38個與基序匹配分值高(以8為界值)的基因作為候選可能受CRP直接調(diào)控的靶基因。后續(xù)的實時定量RT-PCR和凝膠阻滯實驗(EMSA)顯示有36個基因或者假定的操縱子受CRP直接調(diào)控，構(gòu)

8、成了鼠疫菌CRP的最小調(diào)控元，其中YPO2468的芯片表達(dá)譜結(jié)果與實時定量RT-PCR不一致，而yopD雖然芯片表達(dá)譜，實時定量RT-PCR，EMSA以及足跡實驗都證實可能為CRP調(diào)控元，但引物延伸和lacZ報告基因融合實驗并未發(fā)現(xiàn)CRP對yopD有直接調(diào)控作用，因此這兩個基因不是CRP調(diào)控元。pla，pst和ypkA的lacZ融合實驗證實CRP能正調(diào)控水平獲得的質(zhì)?；騪la，pst，而負(fù)調(diào)控ypkA。通過引物延伸實驗(Primer

9、extension assay)和DNaseⅠ足跡實驗(DNaseⅠfootprinting assay)定位了pla，pst和sycO—ypkA—yopJ操縱子的轉(zhuǎn)錄起始位點，核心啟動子元件(—10和—35區(qū))和CRP結(jié)合位點，三者一起揭示了CRP與pla，pst，sycO—ypkA—yopj啟動子DNA相互作用的結(jié)構(gòu)圖。 pla，pst的CRP位點均位于啟動子區(qū)—35區(qū)的上游，cAMP—CRP與啟動子DNA結(jié)合后，促進(jìn)RNA

10、聚合酶的轉(zhuǎn)錄，表現(xiàn)為激活轉(zhuǎn)錄作用。 鼠疫菌中的sycO，ypkA和yopJ基因組成一個三聯(lián)體的操縱子，sycO—ypkA—yopJ操縱子上僅有一個受CRP調(diào)控的啟動子，但是啟動子上有2個CRP結(jié)合位點(位點1和位點2)，并且只在位點1上找到CRP box的同源序列，說明位點1是真正的CRP位點，而位點2應(yīng)該是無效位點。而sycO的CRP位點則位于—10區(qū)的下游，阻礙了RNA聚合酶的轉(zhuǎn)錄延伸，因此表現(xiàn)為抑制調(diào)控作用。 無論

11、是CRP蛋白還是pla，pst和sycO—ypkA—yopJ啟動子區(qū)，其在4種鼠疫菌生物型中，即古生型，中世紀(jì)型，東方型和田鼠型，是相當(dāng)保守的。因此，本研究中的田鼠型鼠疫菌的結(jié)果可以普遍運(yùn)用于其它鼠疫生物型中。 通過上述實驗，不僅首次界定了鼠疫菌田鼠型的CRP最小調(diào)控元，推測出CRP可能的調(diào)控元。結(jié)合相應(yīng)的體內(nèi)外表型實驗，進(jìn)一步證實并精細(xì)研究了CRP直接調(diào)控毒力基因pla，pst和sycO—ypkA—yopJ操縱子的機(jī)制。CRP