沙門(mén)菌質(zhì)粒毒力基因spvC敲除株的構(gòu)建及其對(duì)宿主細(xì)胞自噬的影響.pdf

1、目的：
　　通過(guò)λRed重組系統(tǒng)構(gòu)建鼠傷寒沙門(mén)菌質(zhì)粒毒力基因（Salmonella plasmid virulence gene,spv）spvC敲除株STM-ΔspvC，并利用原核表達(dá)載體pBAD/gⅢ構(gòu)建spvC回補(bǔ)株STM-c-spvC。以鼠傷寒沙門(mén)菌（Salmonella entericaserovar Typhimurium，S.typhimurium，STM）野生株STM-WT和所構(gòu)建菌株作為受試菌，建立斑馬魚(yú)和HeL

2、a細(xì)胞感染模型，研究spvC在感染過(guò)程中對(duì)宿主細(xì)胞自噬的影響，并探究其可能的作用機(jī)制，為通過(guò)調(diào)控細(xì)胞自噬來(lái)預(yù)防和控制沙門(mén)菌感染提供新的思路和方法。
　　方法：
　　一、沙門(mén)菌質(zhì)粒毒力基因spvC敲除株和回補(bǔ)株的構(gòu)建
　　1.利用λRed重組系統(tǒng)構(gòu)建spvC敲除株
　　根據(jù)spvC基因上下游序列設(shè)計(jì)5'端含有spvC同源序列的引物，以質(zhì)粒pKD4為模板，擴(kuò)增得到兩側(cè)含F(xiàn)RT位點(diǎn)、中間為卡那霉素抗性基因的線性DNA片

3、段。同時(shí)利用已電轉(zhuǎn)入質(zhì)粒pKD46的STM-WT菌株，經(jīng)L-阿拉伯糖誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白，使其具有同源重組的能力。將線性 DNA片段電轉(zhuǎn)入具重組功能的感受態(tài)STM-WT菌株，利用卡那霉素平板篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，隨后利用表達(dá) Flp重組酶的質(zhì)粒pCP20，將FRT位點(diǎn)之間的卡那霉素素抗性基因消除，用PCR鑒定陽(yáng)性菌株。Western Blot檢測(cè)沙門(mén)菌野生株STM-WT和spvC敲除株STM-ΔspvC感染HeLa細(xì)胞后ERK磷酸化水平。

4、　　2.沙門(mén)菌質(zhì)粒毒力基因spvC回補(bǔ)株的構(gòu)建
　　根據(jù)Gene Bank中spvC基因的序列設(shè)計(jì)含有DNA限制性酶切位點(diǎn)（XhoI和EcoRI）序列的spvC特異性引物spvC-F（XhoI）和spvC-R（EcoRI），以鼠傷寒沙門(mén)菌野生株STM-WT全基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增spvC基因序列DNA片段。將擴(kuò)增得到的spvC DNA片段和原核表達(dá)載體pBAD/gⅢ分別用DNA限制性內(nèi)切酶XhoI和EcoRI雙酶切，然后將

5、酶切產(chǎn)物在T4 DNA連接酶作用下定向連接。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α，PCR篩選陽(yáng)性克隆并測(cè)序。將陽(yáng)性重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至STM-ΔspvC，經(jīng)L-阿拉伯糖誘導(dǎo)之后，收集菌體，提取蛋白，Western Blot檢測(cè)SpvC蛋白的表達(dá)情況。
　　二、沙門(mén)菌質(zhì)粒毒力基因spvC對(duì)斑馬魚(yú)感染過(guò)程和自噬的影響
　　由于鼠傷寒沙門(mén)菌回補(bǔ)株STM-c-spvC需要L-阿拉伯糖誘導(dǎo)，不適于斑馬魚(yú)感染實(shí)驗(yàn)，本部分研究以野生株STM-WT和s

6、pvC敲除株STM-ΔspvC作為受試菌，以1×108cfu/ml細(xì)菌量采用浸染法感染受精后5 d（days post fertilization，dpf）斑馬魚(yú)，感染后6 h（hours post infection，hpi）將斑馬魚(yú)轉(zhuǎn)移到無(wú)菌Holtfreter buffer培養(yǎng)液中，分別在6、24、72、120 hpi收集斑馬魚(yú)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
　　1.普通光學(xué)顯微鏡觀察斑馬魚(yú)腸道形態(tài)學(xué)變化
　　分別在不同時(shí)間點(diǎn)收集斑馬魚(yú)，

7、無(wú)菌PBS洗3次，將斑馬魚(yú)置于倒置顯微鏡下觀察不同感染組斑馬魚(yú)腸道形態(tài)學(xué)變化。
　　2.活菌計(jì)數(shù)
　　于不同感染時(shí)間點(diǎn)收集斑馬魚(yú)后，通過(guò)平板菌落計(jì)數(shù)法分別對(duì)斑馬魚(yú)全魚(yú)和斑馬魚(yú)細(xì)胞內(nèi)（利用阿米卡星殺死胞外菌）活菌進(jìn)行計(jì)數(shù)。
　　3.透射電子顯微鏡觀察斑馬魚(yú)腸黏膜上皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)
　　在72 hpi收集斑馬魚(yú)，透射電子顯微鏡下觀察比較不同感染組斑馬魚(yú)腸道超微結(jié)構(gòu)變化，并觀察斑馬魚(yú)腸黏膜上皮細(xì)胞內(nèi)自噬體的形成。

8、　　4.Western Blot檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白Lc3和Beclin1的表達(dá)水平
　　收集不同感染時(shí)間點(diǎn)的斑馬魚(yú)，提取蛋白，Western Blot檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白Lc3和Beclin1的表達(dá)。
　　三、沙門(mén)菌質(zhì)粒毒力基因spvC對(duì)HeLa細(xì)胞自噬的影響及機(jī)制探討
　　以鼠傷寒沙門(mén)菌野生株 STM-WT、spvC敲除株 STM-ΔspvC和回補(bǔ)株STM-c-spvC作為受試菌，按感染復(fù)數(shù)（multiplicity of

9、 infection，MOI）100:1感染HeLa細(xì)胞，建立HeLa細(xì)胞感染模型，并以ERK抑制劑（PD0325901）干預(yù)，分別在感染后0.5 h、2 h和6 h收集細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
　　1.瑞氏吉姆薩染色分析細(xì)菌與HeLa細(xì)胞的共作用
　　分別在不同時(shí)間點(diǎn)收集細(xì)胞后，用PBS洗滌3，甲醇固定10 min，干燥，瑞氏吉姆薩染色。光鏡下觀察比較不同感染組細(xì)菌入侵、胞內(nèi)增殖和感染細(xì)胞的狀態(tài)。
　　2. ERK抑制劑工作濃

10、度的確定
　　分別以0、5、10、20、50、100 nM ERK抑制劑（PD0325901）預(yù)處理HeLa細(xì)胞24 h，Western Blot檢測(cè) ERK磷酸化水平，并用噻唑藍(lán)還原法（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）測(cè)定HeLa細(xì)胞存活率，以確定PD0325901的工作濃度。
　　3.細(xì)胞內(nèi)活菌計(jì)數(shù)
　　平板菌落計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)不同感染組 HeLa細(xì)胞內(nèi)菌落形成單位（colony-for

11、ming unit，CFU），利用ERK抑制劑（PD0325901）干預(yù)，比較干預(yù)前后胞內(nèi)CFU數(shù)目變化。
　　4.Western Blot檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白LC3和Beclin1的表達(dá)水平
　　收集感染后細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，Western Blot檢測(cè)不同感染組PD0325901處理前后自噬相關(guān)蛋白LC3與Beclin1表達(dá)水平的變化。
　　5.免疫熒光檢測(cè)細(xì)菌與p62蛋白共定位
　　收集感染后2 h的HeLa

12、細(xì)胞，綠色熒光抗體標(biāo)記p62蛋白，Hochest標(biāo)記細(xì)菌和細(xì)胞核，激光共聚焦顯微鏡（confocal laser scanning microscope，CLSM）觀察不同感染組經(jīng)PD0325901處理前后p62蛋白與細(xì)菌共定位的情況。
　　6. CLSM觀察自LC3點(diǎn)狀聚集
　　利用穩(wěn)定轉(zhuǎn)染mRFP-GFP-LC3的HeLa細(xì)胞建立感染模型，感染2 h后收集細(xì)胞，Hochest標(biāo)記細(xì)菌和細(xì)胞核，CLSM下觀察LC3點(diǎn)狀聚集

13、和細(xì)菌與LC3共定位，比較不同感染組和PD0325901處理前后LC3點(diǎn)狀聚集的變化。
　　結(jié)果：
　　一、沙門(mén)菌質(zhì)粒毒力基因spvC敲除株和回補(bǔ)株的構(gòu)建
　　1.利用λRed重組系統(tǒng)構(gòu)建spvC敲除株STM-ΔspvC
　　PCR鑒定結(jié)果顯示沙門(mén)菌質(zhì)粒毒力基因spvC被敲除，Western Blot檢測(cè)spvC敲除株感染HeLa細(xì)胞后ERK磷酸化水平升高，證實(shí)了spvC敲除株STM-ΔspvC的成功構(gòu)建。

14、>　　2.沙門(mén)菌質(zhì)粒毒力基因spvC回補(bǔ)株STM-c-spvC的構(gòu)建
　　PCR鑒定和測(cè)序結(jié)果顯示pBAD-spvC重組質(zhì)粒成功構(gòu)建，轉(zhuǎn)化入spvC敲除株STM-ΔspvC后，經(jīng)L-阿拉伯糖誘導(dǎo)，Western Blot檢測(cè)到SpvC蛋白的表達(dá)。
　　二、沙門(mén)菌質(zhì)粒毒力基因spvC對(duì)斑馬魚(yú)感染過(guò)程和自噬的影響
　　1.普通光學(xué)顯微鏡觀察斑馬魚(yú)腸道形態(tài)學(xué)變化
　　隨著感染時(shí)間的延長(zhǎng)，STM-WT和STM-ΔspvC

15、感染組與對(duì)照組相比斑馬魚(yú)腸腔均變狹窄，但在STM-WT感染組這種情況更為嚴(yán)重，在STM-WT感染組中腸道內(nèi)容物模糊不清，腸腔內(nèi)面積有所減少。
　　2.活菌計(jì)數(shù)
　　斑馬魚(yú)全魚(yú)計(jì)數(shù)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨感染時(shí)間的延長(zhǎng)STM-WT和STM-ΔspvC感染組全魚(yú)內(nèi)活菌數(shù)均顯著增加（P<0.001）；斑馬魚(yú)細(xì)胞內(nèi)活菌計(jì)數(shù)結(jié)果顯示，在72 hpi侵入斑馬魚(yú)細(xì)胞內(nèi)的STM-WT菌量顯著高于STM-ΔspvC菌量（P<0.05），且這種差異在120

16、 hpi更加明顯（P<0.001）。
　　3.透射電子顯微鏡觀察斑馬魚(yú)腸黏膜上皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)
　　在72 hpi，STM-WT感染組斑馬魚(yú)腸黏膜微絨毛排列不整齊，有部分脫落，且腸腔內(nèi)可見(jiàn)較多細(xì)菌；STM-ΔspvC感染組腸黏膜微絨毛排列相對(duì)整齊，形態(tài)基本正常，未見(jiàn)脫落現(xiàn)象，腸腔內(nèi)細(xì)菌數(shù)量相對(duì)較少。且在STM-ΔspvC感染組斑馬魚(yú)腸黏膜上皮細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)自噬體雙層膜結(jié)構(gòu)的自噬體。
　　4.Western Blot檢測(cè)自噬相

17、關(guān)蛋白Lc3和Beclin1的表達(dá)水平
　　在24 hpi，STM-ΔspvC感染組與STM-WT感染組相比，Lc3-II/Lc3-I比值和Beclin1表達(dá)量升高（P<0.05），且這種差異在72 hpi更為明顯（P<0.01）。
　　三、沙門(mén)菌質(zhì)粒毒力基因spvC對(duì)HeLa細(xì)胞自噬的影響及機(jī)制探討
　　1.瑞氏吉姆薩染色觀察沙門(mén)菌與HeLa細(xì)胞的共作用
　　瑞氏吉姆薩染色結(jié)果顯示，感染后0.5 h沙門(mén)菌已侵入

18、到HeLa細(xì)胞內(nèi)，胞內(nèi)有少量細(xì)菌，且細(xì)胞形態(tài)完好；感染后2 h胞內(nèi)細(xì)菌數(shù)量明顯增多，大部分細(xì)胞形態(tài)正常，少數(shù)細(xì)胞質(zhì)松散，結(jié)構(gòu)被破壞；感染后6 h部分細(xì)胞崩解，且這種情況在STM-WT和STM-c-spvC感染組更為明顯。
　　2. ERK抑制劑工作濃度的確定
　　Western Blot結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在50 nM和100 nM ERK抑制劑（PD0325901）作用下，HeLa細(xì)胞中ERK磷酸化得到較好地抑制。MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示

19、，在50 nM PD0325901作用下，細(xì)胞存活率達(dá)70％。故將50 nM作為PD0325901的工作濃度干預(yù)HeLa細(xì)胞。
　　3.細(xì)胞內(nèi)活菌計(jì)數(shù)
　　胞內(nèi)CFU計(jì)數(shù)結(jié)果顯示，在感染后0.5 h，各感染組間胞內(nèi)CFU數(shù)沒(méi)有顯著差異；在感染后2 h和6 h，STM-ΔspvC感染組胞內(nèi)活菌數(shù)顯著少于STM-WT和STM-c-spvC感染組（P<0.05）。PD0325901預(yù)處理后,在感染6 h，STM-ΔspvC感染組與

20、STM-WT感染組相比沒(méi)有顯著差異。
　　4.Western Blot檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白LC3和Beclin1的表達(dá)水平
　　Western Blot結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在感染后0.5 h和6 h，各感染組中LC3-II/LC3-I比值和Beclin1蛋白表達(dá)量沒(méi)有顯著差別。在感染后2 h，STM-ΔspvC感染組與STM-WT感染組相比，LC3-II/LC3-I比值和Beclin1蛋白表達(dá)量均顯著升高（P<0.05）。在PD03259

21、01處理之后，這種升高均被抑制。
　　5.免疫熒光檢測(cè)沙門(mén)菌與p62蛋白共定位
　　CLSM觀察結(jié)果顯示，STM-ΔspvC感染組與STM-WT、STM-c-spvC感染組相比，p62點(diǎn)狀聚集和胞內(nèi)菌共定位數(shù)目增多（P<0.05）。在PD0325901處理之后，p62點(diǎn)狀聚集和胞內(nèi)菌共定位數(shù)目在各組間無(wú)明顯差異。
　　6.CLSM觀察自噬體的形成
　　CLSM觀察結(jié)果發(fā)現(xiàn)在STM-ΔspvC感染組，LC3黃色（自

22、噬體）和紅色（自噬溶酶體）點(diǎn)狀聚集數(shù)均多于STM-WT和STM-c-spvC感染組，且LC3與胞內(nèi)菌共定位數(shù)目也顯著多于另兩組（P<0.05）。PD0325901處理之后，各感染組LC3黃色和紅色點(diǎn)狀聚集物數(shù)均減少，且各組間沒(méi)有顯著差別。
　　結(jié)論：
　　1.利用λRed重組系統(tǒng)成功構(gòu)建了鼠傷寒沙門(mén)菌spvC敲除株STM-ΔspvC。
　　2.利用原核表達(dá)載體 pBAD/gⅢ成功構(gòu)建了鼠傷寒沙門(mén)菌 spvC回補(bǔ)株STM