沙門菌質(zhì)粒毒力基因spvC敲除株的構建及其對宿主細胞自噬的影響.pdf

1、目的：
　　通過λRed重組系統(tǒng)構建鼠傷寒沙門菌質(zhì)粒毒力基因（Salmonella plasmid virulence gene,spv）spvC敲除株STM-ΔspvC，并利用原核表達載體pBAD/gⅢ構建spvC回補株STM-c-spvC。以鼠傷寒沙門菌（Salmonella entericaserovar Typhimurium，S.typhimurium，STM）野生株STM-WT和所構建菌株作為受試菌，建立斑馬魚和HeL

2、a細胞感染模型，研究spvC在感染過程中對宿主細胞自噬的影響，并探究其可能的作用機制，為通過調(diào)控細胞自噬來預防和控制沙門菌感染提供新的思路和方法。
　　方法：
　　一、沙門菌質(zhì)粒毒力基因spvC敲除株和回補株的構建
　　1.利用λRed重組系統(tǒng)構建spvC敲除株
　　根據(jù)spvC基因上下游序列設計5'端含有spvC同源序列的引物，以質(zhì)粒pKD4為模板，擴增得到兩側含F(xiàn)RT位點、中間為卡那霉素抗性基因的線性DNA片

3、段。同時利用已電轉入質(zhì)粒pKD46的STM-WT菌株，經(jīng)L-阿拉伯糖誘導表達重組蛋白，使其具有同源重組的能力。將線性 DNA片段電轉入具重組功能的感受態(tài)STM-WT菌株，利用卡那霉素平板篩選陽性轉化子，隨后利用表達 Flp重組酶的質(zhì)粒pCP20，將FRT位點之間的卡那霉素素抗性基因消除，用PCR鑒定陽性菌株。Western Blot檢測沙門菌野生株STM-WT和spvC敲除株STM-ΔspvC感染HeLa細胞后ERK磷酸化水平。

4、　　2.沙門菌質(zhì)粒毒力基因spvC回補株的構建
　　根據(jù)Gene Bank中spvC基因的序列設計含有DNA限制性酶切位點（XhoI和EcoRI）序列的spvC特異性引物spvC-F（XhoI）和spvC-R（EcoRI），以鼠傷寒沙門菌野生株STM-WT全基因組DNA為模板，PCR擴增spvC基因序列DNA片段。將擴增得到的spvC DNA片段和原核表達載體pBAD/gⅢ分別用DNA限制性內(nèi)切酶XhoI和EcoRI雙酶切，然后將

5、酶切產(chǎn)物在T4 DNA連接酶作用下定向連接。重組質(zhì)粒轉化至大腸桿菌DH5α，PCR篩選陽性克隆并測序。將陽性重組質(zhì)粒轉化至STM-ΔspvC，經(jīng)L-阿拉伯糖誘導之后，收集菌體，提取蛋白，Western Blot檢測SpvC蛋白的表達情況。
　　二、沙門菌質(zhì)粒毒力基因spvC對斑馬魚感染過程和自噬的影響
　　由于鼠傷寒沙門菌回補株STM-c-spvC需要L-阿拉伯糖誘導，不適于斑馬魚感染實驗，本部分研究以野生株STM-WT和s

6、pvC敲除株STM-ΔspvC作為受試菌，以1×108cfu/ml細菌量采用浸染法感染受精后5 d（days post fertilization，dpf）斑馬魚，感染后6 h（hours post infection，hpi）將斑馬魚轉移到無菌Holtfreter buffer培養(yǎng)液中，分別在6、24、72、120 hpi收集斑馬魚進行實驗。
　　1.普通光學顯微鏡觀察斑馬魚腸道形態(tài)學變化
　　分別在不同時間點收集斑馬魚，

7、無菌PBS洗3次，將斑馬魚置于倒置顯微鏡下觀察不同感染組斑馬魚腸道形態(tài)學變化。
　　2.活菌計數(shù)
　　于不同感染時間點收集斑馬魚后，通過平板菌落計數(shù)法分別對斑馬魚全魚和斑馬魚細胞內(nèi)（利用阿米卡星殺死胞外菌）活菌進行計數(shù)。
　　3.透射電子顯微鏡觀察斑馬魚腸黏膜上皮細胞超微結構
　　在72 hpi收集斑馬魚，透射電子顯微鏡下觀察比較不同感染組斑馬魚腸道超微結構變化，并觀察斑馬魚腸黏膜上皮細胞內(nèi)自噬體的形成。

8、　　4.Western Blot檢測自噬相關蛋白Lc3和Beclin1的表達水平
　　收集不同感染時間點的斑馬魚，提取蛋白，Western Blot檢測自噬相關蛋白Lc3和Beclin1的表達。
　　三、沙門菌質(zhì)粒毒力基因spvC對HeLa細胞自噬的影響及機制探討
　　以鼠傷寒沙門菌野生株 STM-WT、spvC敲除株 STM-ΔspvC和回補株STM-c-spvC作為受試菌，按感染復數(shù)（multiplicity of

9、 infection，MOI）100:1感染HeLa細胞，建立HeLa細胞感染模型，并以ERK抑制劑（PD0325901）干預，分別在感染后0.5 h、2 h和6 h收集細胞進行實驗。
　　1.瑞氏吉姆薩染色分析細菌與HeLa細胞的共作用
　　分別在不同時間點收集細胞后，用PBS洗滌3，甲醇固定10 min，干燥，瑞氏吉姆薩染色。光鏡下觀察比較不同感染組細菌入侵、胞內(nèi)增殖和感染細胞的狀態(tài)。
　　2. ERK抑制劑工作濃

10、度的確定
　　分別以0、5、10、20、50、100 nM ERK抑制劑（PD0325901）預處理HeLa細胞24 h，Western Blot檢測 ERK磷酸化水平，并用噻唑藍還原法（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）測定HeLa細胞存活率，以確定PD0325901的工作濃度。
　　3.細胞內(nèi)活菌計數(shù)
　　平板菌落計數(shù)法計數(shù)不同感染組 HeLa細胞內(nèi)菌落形成單位（colony-for

11、ming unit，CFU），利用ERK抑制劑（PD0325901）干預，比較干預前后胞內(nèi)CFU數(shù)目變化。
　　4.Western Blot檢測自噬相關蛋白LC3和Beclin1的表達水平
　　收集感染后細胞，提取細胞總蛋白，Western Blot檢測不同感染組PD0325901處理前后自噬相關蛋白LC3與Beclin1表達水平的變化。
　　5.免疫熒光檢測細菌與p62蛋白共定位
　　收集感染后2 h的HeLa

12、細胞，綠色熒光抗體標記p62蛋白，Hochest標記細菌和細胞核，激光共聚焦顯微鏡（confocal laser scanning microscope，CLSM）觀察不同感染組經(jīng)PD0325901處理前后p62蛋白與細菌共定位的情況。
　　6. CLSM觀察自LC3點狀聚集
　　利用穩(wěn)定轉染mRFP-GFP-LC3的HeLa細胞建立感染模型，感染2 h后收集細胞，Hochest標記細菌和細胞核，CLSM下觀察LC3點狀聚集

13、和細菌與LC3共定位，比較不同感染組和PD0325901處理前后LC3點狀聚集的變化。
　　結果：
　　一、沙門菌質(zhì)粒毒力基因spvC敲除株和回補株的構建
　　1.利用λRed重組系統(tǒng)構建spvC敲除株STM-ΔspvC
　　PCR鑒定結果顯示沙門菌質(zhì)粒毒力基因spvC被敲除，Western Blot檢測spvC敲除株感染HeLa細胞后ERK磷酸化水平升高，證實了spvC敲除株STM-ΔspvC的成功構建。

14、>　　2.沙門菌質(zhì)粒毒力基因spvC回補株STM-c-spvC的構建
　　PCR鑒定和測序結果顯示pBAD-spvC重組質(zhì)粒成功構建，轉化入spvC敲除株STM-ΔspvC后，經(jīng)L-阿拉伯糖誘導，Western Blot檢測到SpvC蛋白的表達。
　　二、沙門菌質(zhì)粒毒力基因spvC對斑馬魚感染過程和自噬的影響
　　1.普通光學顯微鏡觀察斑馬魚腸道形態(tài)學變化
　　隨著感染時間的延長，STM-WT和STM-ΔspvC

15、感染組與對照組相比斑馬魚腸腔均變狹窄，但在STM-WT感染組這種情況更為嚴重，在STM-WT感染組中腸道內(nèi)容物模糊不清，腸腔內(nèi)面積有所減少。
　　2.活菌計數(shù)
　　斑馬魚全魚計數(shù)結果發(fā)現(xiàn)，隨感染時間的延長STM-WT和STM-ΔspvC感染組全魚內(nèi)活菌數(shù)均顯著增加（P<0.001）；斑馬魚細胞內(nèi)活菌計數(shù)結果顯示，在72 hpi侵入斑馬魚細胞內(nèi)的STM-WT菌量顯著高于STM-ΔspvC菌量（P<0.05），且這種差異在120

16、 hpi更加明顯（P<0.001）。
　　3.透射電子顯微鏡觀察斑馬魚腸黏膜上皮細胞超微結構
　　在72 hpi，STM-WT感染組斑馬魚腸黏膜微絨毛排列不整齊，有部分脫落，且腸腔內(nèi)可見較多細菌；STM-ΔspvC感染組腸黏膜微絨毛排列相對整齊，形態(tài)基本正常，未見脫落現(xiàn)象，腸腔內(nèi)細菌數(shù)量相對較少。且在STM-ΔspvC感染組斑馬魚腸黏膜上皮細胞內(nèi)可見自噬體雙層膜結構的自噬體。
　　4.Western Blot檢測自噬相

17、關蛋白Lc3和Beclin1的表達水平
　　在24 hpi，STM-ΔspvC感染組與STM-WT感染組相比，Lc3-II/Lc3-I比值和Beclin1表達量升高（P<0.05），且這種差異在72 hpi更為明顯（P<0.01）。
　　三、沙門菌質(zhì)粒毒力基因spvC對HeLa細胞自噬的影響及機制探討
　　1.瑞氏吉姆薩染色觀察沙門菌與HeLa細胞的共作用
　　瑞氏吉姆薩染色結果顯示，感染后0.5 h沙門菌已侵入

18、到HeLa細胞內(nèi)，胞內(nèi)有少量細菌，且細胞形態(tài)完好；感染后2 h胞內(nèi)細菌數(shù)量明顯增多，大部分細胞形態(tài)正常，少數(shù)細胞質(zhì)松散，結構被破壞；感染后6 h部分細胞崩解，且這種情況在STM-WT和STM-c-spvC感染組更為明顯。
　　2. ERK抑制劑工作濃度的確定
　　Western Blot結果發(fā)現(xiàn)，在50 nM和100 nM ERK抑制劑（PD0325901）作用下，HeLa細胞中ERK磷酸化得到較好地抑制。MTT實驗結果顯示

19、，在50 nM PD0325901作用下，細胞存活率達70％。故將50 nM作為PD0325901的工作濃度干預HeLa細胞。
　　3.細胞內(nèi)活菌計數(shù)
　　胞內(nèi)CFU計數(shù)結果顯示，在感染后0.5 h，各感染組間胞內(nèi)CFU數(shù)沒有顯著差異；在感染后2 h和6 h，STM-ΔspvC感染組胞內(nèi)活菌數(shù)顯著少于STM-WT和STM-c-spvC感染組（P<0.05）。PD0325901預處理后,在感染6 h，STM-ΔspvC感染組與

20、STM-WT感染組相比沒有顯著差異。
　　4.Western Blot檢測自噬相關蛋白LC3和Beclin1的表達水平
　　Western Blot結果發(fā)現(xiàn)，在感染后0.5 h和6 h，各感染組中LC3-II/LC3-I比值和Beclin1蛋白表達量沒有顯著差別。在感染后2 h，STM-ΔspvC感染組與STM-WT感染組相比，LC3-II/LC3-I比值和Beclin1蛋白表達量均顯著升高（P<0.05）。在PD03259

21、01處理之后，這種升高均被抑制。
　　5.免疫熒光檢測沙門菌與p62蛋白共定位
　　CLSM觀察結果顯示，STM-ΔspvC感染組與STM-WT、STM-c-spvC感染組相比，p62點狀聚集和胞內(nèi)菌共定位數(shù)目增多（P<0.05）。在PD0325901處理之后，p62點狀聚集和胞內(nèi)菌共定位數(shù)目在各組間無明顯差異。
　　6.CLSM觀察自噬體的形成
　　CLSM觀察結果發(fā)現(xiàn)在STM-ΔspvC感染組，LC3黃色（自

22、噬體）和紅色（自噬溶酶體）點狀聚集數(shù)均多于STM-WT和STM-c-spvC感染組，且LC3與胞內(nèi)菌共定位數(shù)目也顯著多于另兩組（P<0.05）。PD0325901處理之后，各感染組LC3黃色和紅色點狀聚集物數(shù)均減少，且各組間沒有顯著差別。
　　結論：
　　1.利用λRed重組系統(tǒng)成功構建了鼠傷寒沙門菌spvC敲除株STM-ΔspvC。
　　2.利用原核表達載體 pBAD/gⅢ成功構建了鼠傷寒沙門菌 spvC回補株STM