副豬嗜血桿菌喹諾酮耐藥分子特征及豬鏈球菌多重耐藥機(jī)制研究.pdf

1、細(xì)菌耐藥性是細(xì)菌抵抗藥物殺傷或抑制作用的一種表型，是制約臨床細(xì)菌疾病預(yù)防和治療的一個(gè)重要因素。隨著抗菌藥物的研究與發(fā)展，其臨床應(yīng)用也越來(lái)越廣泛，甚至一些濫用現(xiàn)象也開(kāi)始頻繁出現(xiàn)，這都為細(xì)菌耐藥性的出現(xiàn)提供了有利條件。近年來(lái)，細(xì)菌的耐藥性問(wèn)題越來(lái)越嚴(yán)峻(Aarestrup2005)，細(xì)菌的耐藥性正在朝著高耐藥率，多重耐藥的方向發(fā)展，已經(jīng)成為了一個(gè)嚴(yán)重的人類公共衛(wèi)生問(wèn)題。副豬嗜血桿菌(HPS)和豬鏈球菌(SS)作為全球性的重要的豬傳染病病原，

2、近年來(lái)隨著養(yǎng)豬業(yè)的快速發(fā)展，其耐藥情況也越來(lái)越嚴(yán)重，本論文對(duì)其耐藥機(jī)制分別進(jìn)行了研究，主要的成果如下:
　　1、副豬嗜血桿菌臨床分離菌株喹諾酮耐藥分子機(jī)制研究
　　本研究中，以138株HPS臨床分離菌株為研究對(duì)象，首先利用E-test藥敏紙條分別檢測(cè)每株細(xì)菌對(duì)恩諾沙星和左旋氧氟沙星的MIC值，根據(jù)2008年頒布的CLSI標(biāo)準(zhǔn)，判定138株HPS的耐藥情況分別為:恩諾沙星的耐藥率為60.1％，左旋氧氟沙星的耐藥率為5.8％，并

3、且左旋氧氟沙星的耐藥菌株對(duì)恩諾沙星均表現(xiàn)出了高水平的耐藥性。進(jìn)一步，通過(guò)測(cè)序分析喹諾酮耐藥相關(guān)基因DNA解旋酶(GyrA、GyrB)和拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅳ(ParC、ParE)的突變情況，結(jié)合各菌株的耐藥性，共發(fā)現(xiàn)了10個(gè)耐藥相關(guān)基因突變位點(diǎn)。其中，GyrA87位點(diǎn)在所有恩諾沙星耐藥菌株中的突變率為100％，提示了GyrA87位點(diǎn)的突變對(duì)HPS喹諾酮耐藥性形成的重要性;進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)ParC73位點(diǎn)的突變，能夠協(xié)助其它相關(guān)突變位點(diǎn)增強(qiáng)HPS對(duì)喹

4、諾酮藥物的耐受性;甚至，本研究中還首次發(fā)現(xiàn)了ParE的耐藥相關(guān)突變位點(diǎn)（ParE551位點(diǎn)的突變）。為了更加直接的證明DNA解旋酶和拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅳ的突變是引起HPS耐受恩諾沙星和左旋氧氟沙星的原因，本研究中，進(jìn)行了定向點(diǎn)突變實(shí)驗(yàn)，分別為:GyrA(87D→N)、 ParC(73S→R)、ParE(551T→A)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這3個(gè)位點(diǎn)的突變均能使細(xì)菌對(duì)恩諾沙星和左旋氧氟沙星的MIC值明顯升高，證明了DNA解旋酶和拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅳ的突變確實(shí)是引起細(xì)

5、菌耐受喹諾酮的重要原因。另外，本研究中繼續(xù)分析了HPS的假設(shè)毒力因子與其喹諾酮耐藥性之間的相關(guān)性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HPS的喹諾酮耐藥菌株較其敏感菌株，含有更多的假設(shè)毒力因子（hh dA、fimB和hsdR），表明在HPS中，喹諾酮耐藥性與其假設(shè)毒力因子之間存在正相關(guān)性，這一結(jié)果不同于以往的任何相關(guān)報(bào)道，這為該方面的研究提供了新的視野，使其更加全面和豐富。
　　2、豬鏈球菌R61多重耐藥機(jī)制的研究
　　R61是本實(shí)驗(yàn)室前期工作中發(fā)現(xiàn)的

6、一株“超級(jí)耐藥”豬鏈球菌，雖然通過(guò)比較基因組學(xué)分析部分解釋了其耐藥機(jī)制，但是卻并不完善，因此，本研究以R61為研究對(duì)象，繼續(xù)對(duì)其多重耐藥機(jī)制展開(kāi)了研究。首先，將R61在不同條件下培養(yǎng)（分別添加阿莫西林、氯霉素、頭孢噻肟、紅霉素、左氧氟沙星、四環(huán)素，無(wú)抗生素添加，以及同時(shí)添加上述6種抗生素），待其生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)中期時(shí)，分別提取其全菌蛋白。然后進(jìn)一步通過(guò)雙向電泳分析藥物刺激后R61的差異表達(dá)蛋白，共46個(gè)（大于2倍），其中上調(diào)表達(dá)蛋白32個(gè)，下

7、調(diào)表達(dá)蛋白14個(gè)，并分別對(duì)這些差異蛋白進(jìn)行質(zhì)譜鑒定。為了進(jìn)一步探索R61的耐藥機(jī)制，結(jié)合各蛋白的功能及特點(diǎn)，選取可能與耐藥性相關(guān)的13個(gè)蛋白（上調(diào)9個(gè)，下調(diào)4個(gè)），分別構(gòu)建其過(guò)表達(dá)菌株（上調(diào)蛋白構(gòu)建A7過(guò)表達(dá)菌株，下調(diào)蛋白構(gòu)建R61過(guò)表達(dá)菌株）并檢測(cè)其MIC值的變化情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn):SSUR61_0413（β-內(nèi)酰胺水解酶）和SSUR61_2137（新陳代謝控制蛋白A）基因的上調(diào)，以及SSUR61_1509（自溶素）的下調(diào)，均能夠使細(xì)菌對(duì)