副豬嗜血桿菌耐藥性調(diào)查和耐藥機(jī)制研究.pdf

1、副豬嗜血桿菌(Haemophilusparasuis，HPS)是引起豬的多發(fā)性漿膜炎、腦膜炎和關(guān)節(jié)炎的一種革蘭氏陰性桿菌。副豬嗜血桿菌病又稱為Gl(a)sser's病，給世界養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。副豬嗜血桿菌具有15個(gè)血清型和不可分型菌株，有很強(qiáng)的宿主特異性，2周齡到4月齡的豬易感，尤其對(duì)早期斷奶仔豬造成了嚴(yán)重的危害。目前主要通過滅活苗和抗生素來預(yù)防和控制副豬嗜血桿菌病，但單價(jià)疫苗免疫不能產(chǎn)生交叉保護(hù)作用，所以通過抗生素進(jìn)行預(yù)防和

2、治療該病，仍是一種常見的方法。而抗生素的不合理使用導(dǎo)致越來越多的細(xì)菌對(duì)抗生素產(chǎn)生了耐藥性，嚴(yán)重影響了抗生素的殺菌作用。近年來，許多國(guó)家都報(bào)道了副豬嗜血桿菌存在耐藥現(xiàn)象，因此，有必要對(duì)副豬嗜血桿菌進(jìn)行耐藥性調(diào)查和耐藥機(jī)制研究。本研究首先對(duì)臨床菌株進(jìn)行了耐藥流行病學(xué)調(diào)查和內(nèi)源性質(zhì)粒的分離鑒定，然后分析青霉素結(jié)合蛋白的突變位點(diǎn)與氨芐青霉素耐藥菌株和攜帶內(nèi)源性質(zhì)粒菌株之間的關(guān)系。同時(shí)，通過基因表達(dá)譜芯片研究副豬嗜血桿菌SH0165在亞抑制濃度和

3、抑制濃度替米考星作用下的轉(zhuǎn)錄組學(xué)變化，揭示了亞抑制濃度和抑制濃度（0.25μg/mL和8μg/mL）替米考星的作用機(jī)制?，F(xiàn)將主要研究結(jié)果報(bào)告如下:
　　 1.副豬嗜血桿菌的耐藥流行病學(xué)調(diào)查和內(nèi)源性質(zhì)粒的分離鑒定
　　 本試驗(yàn)對(duì)2009年分離的92株副豬嗜血桿菌進(jìn)行了10種常用抗生素的耐藥流行病學(xué)調(diào)查，其中存在青霉素(21.74％)、氨芐青霉素(23.91％)、林可霉素(23.91％)、阿莫西林(15.22％)等耐藥菌株，

4、對(duì)頭孢噻肟和氯霉素敏感的菌株，均為90.22％，而22種耐藥基因檢測(cè)存在氨基糖苷類耐藥基因aadB有20株，四環(huán)素類耐藥基因tetB有11株，磺胺類耐藥基因sulⅡ有8株。同時(shí)從92株副豬嗜血桿菌中分離出6株菌株攜帶有內(nèi)源性質(zhì)粒，并對(duì)其中5個(gè)內(nèi)源性質(zhì)粒進(jìn)行了測(cè)序，質(zhì)粒FZJ5839是隱性質(zhì)粒，其余都是耐藥質(zhì)粒。質(zhì)粒pHPS1019編碼耐藥基因tetB和復(fù)制蛋白rep;質(zhì)粒FHN1020和質(zhì)粒FZG1012是來自不同豬場(chǎng)的相同耐藥質(zhì)粒，編

5、碼了鏈霉素類耐藥基因strA和磺胺類耐藥基因sulⅡ及MOB移動(dòng)蛋白家族;質(zhì)粒FJS5863編碼了β-內(nèi)酰胺類耐藥基因blaRoB-1，氨基糖苷類雙功能修飾酶基因aacA-aphD，MOB移動(dòng)蛋白家族和復(fù)制蛋白rep，其中耐藥基因aacA-aphD首次在副豬嗜血桿菌中報(bào)道。隱性質(zhì)粒FZJ5839是測(cè)序中最大的質(zhì)粒(11，812bp)，編碼了移動(dòng)蛋白mobA_mobL，重組酶rec，復(fù)制蛋白rep和分裂蛋白parA。其中攜帶耐藥質(zhì)粒的菌株

6、中只有耐藥基因tetB不表現(xiàn)耐藥表型，其余耐藥基因均存在耐藥表型。而對(duì)分離的內(nèi)源性質(zhì)粒進(jìn)行耐藥基因檢測(cè)，其結(jié)果是不僅存在質(zhì)粒編碼的耐藥基因，也存在耐藥基因blaTEM和dhfr(Ⅴ)等。通過對(duì)耐藥質(zhì)粒進(jìn)行同源性分析發(fā)現(xiàn)與巴斯德菌屬或嗜血桿菌屬中耐藥質(zhì)粒進(jìn)化關(guān)系較近。
　　 2.分析副豬嗜血桿菌青霉素結(jié)合蛋白的突變位點(diǎn)
　　 根據(jù)HPSSH0165的基因組信息，總結(jié)HPS青霉素結(jié)合蛋白(Penicillin-binding

7、proteins，PBPs)的類型，主要包括6類PBPs，其中有4個(gè)HMMPBPs[2個(gè)A類PBPs(mrcA和pbp1B)和2個(gè)B類PBPs（ftsⅠ和ftsⅠ-2）]和2個(gè)LMMPBPs(dacA和dacB)及1個(gè)多功能轉(zhuǎn)糖酶mtgA和1個(gè)PBP3相關(guān)的羧基末端蛋白酶prc。通過瓊脂稀釋法對(duì)2009年選取的22株和2012年分離的34株HPS進(jìn)行6種β-內(nèi)酰胺類抗生素（青霉素，頭孢噻肟，氨芐青霉素，苯唑西林，阿莫西林和克拉維酸）的耐

8、藥檢測(cè)，存在氨芐青霉素和苯唑西林抗性的菌株達(dá)到95％以上，同時(shí)從2012年34株HPS中分離出2個(gè)內(nèi)源性質(zhì)粒。根據(jù)菌株是否對(duì)氨芐青霉素和苯唑西林耐藥，是否攜帶內(nèi)源性質(zhì)粒來選取20株HPS進(jìn)行PBPs的克隆測(cè)序（其中2009年和2012年各10株），參考菌株是HPSSH0165和HPS標(biāo)準(zhǔn)5型，測(cè)序結(jié)果PBPs基因是高度保守的。通過PBPs堿基序列的進(jìn)化樹關(guān)系，預(yù)測(cè)PBPs存在的突變位點(diǎn)，并在蛋白的三維結(jié)構(gòu)上定位突變位點(diǎn)，分析發(fā)現(xiàn)PBPs

9、肽基轉(zhuǎn)移酶上的突變位點(diǎn)與β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥性有關(guān)，糖基轉(zhuǎn)移酶上的突變位點(diǎn)與內(nèi)源性質(zhì)粒傳遞有關(guān)。在攜帶質(zhì)粒FJS5863的菌株09FA17中發(fā)現(xiàn)mrcA基因在突變位點(diǎn)638處插入7個(gè)氨基酸ATENTTD，導(dǎo)致下游有11個(gè)突變位點(diǎn)，并在一定程度上改變了mrcA蛋白的三維結(jié)構(gòu)，推測(cè)該突變與菌株攜帶質(zhì)粒FJS5863編碼的耐藥基因blaROB-1有關(guān)。其中有8株菌的dacB基因在氨基酸C-端插入了199個(gè)氨基酸，推測(cè)與內(nèi)源性質(zhì)粒的傳遞有關(guān)。

10、有5株菌的dacA基因在358氨基酸處突變?yōu)榻K止密碼子。
　　 3.替米考星誘導(dǎo)副豬嗜血桿菌SH0165的轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究
　　 為了揭示替米考星作用于HPSSH0165的分子機(jī)制，根據(jù)HPSSH0165的基因組序列，設(shè)計(jì)了2052個(gè)探針合成基因表達(dá)譜芯片來研究不同濃度(亞抑制濃度0.25μg/mL和抑制濃度8μg/mL)的替米考星對(duì)HPSSH0165的轉(zhuǎn)錄組學(xué)變化，成功篩選到405個(gè)差異表達(dá)基因(p≤0.05，F(xiàn)c≥1.5

11、)，這些基因涉及到熱休克蛋白、核糖體蛋白、蛋白質(zhì)的生物合成、細(xì)胞壁合成和細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的過程。在0.25μg/mL和8μg/mL兩種濃度組中既存在共同變化的基因也存在其特有的差異表達(dá)基因，其中共同上調(diào)表達(dá)的基因有56個(gè)和共同下調(diào)表達(dá)的基因有39個(gè)。在0.25μg/mL濃度組中檢測(cè)出302個(gè)差異表達(dá)基因，在替米考星壓力下正常的生長(zhǎng)以調(diào)節(jié)ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體和PTS系統(tǒng)中基因?yàn)樘攸c(diǎn)，而在8μg/mL濃度組中檢測(cè)出198個(gè)差異表達(dá)基因，因生長(zhǎng)被完全抑制