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文檔簡介
1、本文主要從以下幾個方面進行論述:
第一部分:CYP24A1參與炎癥因子調(diào)控Wnt信號通路的機制研究
目的:CYP24A1編碼1,25-雙羥維生素D3特異性代謝酶,對1,25-雙羥維生素D3局部組織濃度有決定性影響,后者能夠下調(diào)Wnt/β-catenin通路活化程度。CYP24A1在結(jié)腸息肉與結(jié)腸癌中有異常高表達,其SNP分布也與潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)病相關(guān)。細(xì)胞因子IL-6和TNF-α的活化和NF-κB通路的激活在炎癌轉(zhuǎn)化過
2、程中起到關(guān)鍵作用,本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)IL-6和TNF-α可通過NF-κB通路調(diào)控Wnt/β-catenin通路活化。有研究報道,IL-6和TNF-α能夠誘導(dǎo)CYP24A1轉(zhuǎn)錄增多,但對蛋白含量影響尚不明確,且CYP24A1基因的表達調(diào)控是否參與IL-6或TNF-α通過NF-κB通路調(diào)控Wnt/β-catenin通路活化尚無相關(guān)研究。本研究旨在探討CYP24A1在IL-6和TNF-α通過NF-κB通路調(diào)控Wnt通路過程中的作用,進一步明
3、確炎癥與腫瘤發(fā)生之間的關(guān)系與具體機制,為特異性抑制CYP24A1酶活性、增加結(jié)腸組織對1,25-雙羥維生素D3抑癌作用敏感性在預(yù)防UC癌變中的應(yīng)用提供了研究基礎(chǔ)。
方法:本研究將細(xì)胞因子IL-6和TNF-α作用于結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT-116、Caco-2,使用WesternBlot檢測對CYP24A1蛋白表達的影響,使用凝膠遷移實驗(EMSA)檢測對NF-κB通路活化程度的影響,使用Western Blot檢測NF-κB通路特異
4、性抑制劑PDTC對IL-6和TNF-α誘導(dǎo)CYP24A1表達的影響;利用siRNA敲減CYP24A1表達后,雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灆z測IL-6和TNF-α對Wnt信號通路調(diào)控作用的變化,使用Western Blot檢測細(xì)胞核β-catenin蛋白水平。
結(jié)果:IL-6與TNF-α作用于Caco-2和HCT-116細(xì)胞可使CYP24A1表達量增加,且表現(xiàn)為時間、劑量依賴。在Caco-2細(xì)胞系選取IL-6100ng/ml、TNF-
5、α50ng/ml分別作用6h,HCT-116細(xì)胞系選取IL-650ng/ml、TNF-α100ng/ml分別作用6h,NF-κB通路活化程度增加,使用NF-κB通路特異性抑制劑PDTC可明顯抑制IL-6與TNF-α對CYP24A1表達的誘導(dǎo)作用。利用siRNA敲減CYP24A1表達可部分拮抗IL-6和TNF-α誘導(dǎo)的β-catenin核內(nèi)分布增多以及Wnt通路活化(相對熒光素酶活性Caco-2細(xì)胞系IL-63.297±0.1610vs2
6、.527±0.03323,p=0.0221;TNF-α4.130±0.4289vs2.780±0.3092,p=0.0249;HCT116細(xì)胞系IL-61.357±0.03422vs1.086±0.07545,p=0.0048;TNF-α2.374±0.1955vs1.802±0.06163,p=0.0313)。
結(jié)論:在Caco-2和HCT-116細(xì)胞系中,IL-6和TNF-α可能通過誘導(dǎo)NF-κB通路活化進一步促進CYP2
7、4A1表達量增加,促進核內(nèi)β-catenin增多,上調(diào)Wnt通路活化程度。
第二部分:潰瘍性結(jié)腸炎癌變模型小鼠中CYP24A1基因表達與炎癥因子的關(guān)系
目的:本實驗通過建立AOM聯(lián)合DSS小鼠UC癌變模型,給予阻斷炎癥因子TNF-α、NF-κB處理,探究炎癥相關(guān)途徑在UC癌變中對CYP24A1表達的影響。
方法:將C57BL/6小鼠隨機分為4組,第1組為空白對照組,第2-4組建立UC癌變小鼠模型(腹腔注射1
8、2.5mg/kg AOM,1周后給予2.5%DSS的飲用水,連續(xù)5天,之后換成普通飲用水),其中,第2組為模型對照組,第3組給予NF-κB反義寡聚核苷酸每兩周一次灌腸,第4組給予TNF-α單克隆抗體每兩周一次腹腔注射。12周后處死小鼠,統(tǒng)計瘤負(fù)荷,進行病理學(xué)評估,使用免疫組化方法檢測CYP24A1表達情況。
結(jié)果:CYP24A1表達在模型對照組(n=8,2.500±0.3273)中較空白組(n=6,1.167±0.1667)升
9、高(p=0.0067)。NF-κB反義寡聚核苷酸組的瘤負(fù)荷(n=5,1.130±0.1678cm)較模型對照組(n=8,2.294±0.3638cm)顯著下降,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p=0.0354);NF-κB反義寡聚核苷酸組的小鼠結(jié)腸上皮細(xì)胞中CYP24A1表達水平顯著下降(1.400±0.2449vs2.500±0.3273,p=0.0362)。TNF-α單克隆抗體組的瘤負(fù)荷(n=5,1.780±0.5142)較模型對照組(n=8,2
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