CYP24A1參與炎癥因子調(diào)控Wnt信號通路的機制研究.pdf

1、本文主要從以下幾個方面進行論述:
　　第一部分:CYP24A1參與炎癥因子調(diào)控Wnt信號通路的機制研究
　　目的:CYP24A1編碼1，25-雙羥維生素D3特異性代謝酶，對1，25-雙羥維生素D3局部組織濃度有決定性影響，后者能夠下調(diào)Wnt/β-catenin通路活化程度。CYP24A1在結(jié)腸息肉與結(jié)腸癌中有異常高表達，其SNP分布也與潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)病相關(guān)。細胞因子IL-6和TNF-α的活化和NF-κB通路的激活在炎癌轉(zhuǎn)化過

2、程中起到關(guān)鍵作用，本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)IL-6和TNF-α可通過NF-κB通路調(diào)控Wnt/β-catenin通路活化。有研究報道，IL-6和TNF-α能夠誘導CYP24A1轉(zhuǎn)錄增多，但對蛋白含量影響尚不明確，且CYP24A1基因的表達調(diào)控是否參與IL-6或TNF-α通過NF-κB通路調(diào)控Wnt/β-catenin通路活化尚無相關(guān)研究。本研究旨在探討CYP24A1在IL-6和TNF-α通過NF-κB通路調(diào)控Wnt通路過程中的作用，進一步明

3、確炎癥與腫瘤發(fā)生之間的關(guān)系與具體機制，為特異性抑制CYP24A1酶活性、增加結(jié)腸組織對1，25-雙羥維生素D3抑癌作用敏感性在預防UC癌變中的應用提供了研究基礎(chǔ)。
　　方法:本研究將細胞因子IL-6和TNF-α作用于結(jié)腸癌細胞株HCT-116、Caco-2，使用WesternBlot檢測對CYP24A1蛋白表達的影響，使用凝膠遷移實驗(EMSA)檢測對NF-κB通路活化程度的影響，使用Western Blot檢測NF-κB通路特異

4、性抑制劑PDTC對IL-6和TNF-α誘導CYP24A1表達的影響;利用siRNA敲減CYP24A1表達后，雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灆z測IL-6和TNF-α對Wnt信號通路調(diào)控作用的變化，使用Western Blot檢測細胞核β-catenin蛋白水平。
　　結(jié)果:IL-6與TNF-α作用于Caco-2和HCT-116細胞可使CYP24A1表達量增加，且表現(xiàn)為時間、劑量依賴。在Caco-2細胞系選取IL-6100ng/ml、TNF-

5、α50ng/ml分別作用6h，HCT-116細胞系選取IL-650ng/ml、TNF-α100ng/ml分別作用6h，NF-κB通路活化程度增加，使用NF-κB通路特異性抑制劑PDTC可明顯抑制IL-6與TNF-α對CYP24A1表達的誘導作用。利用siRNA敲減CYP24A1表達可部分拮抗IL-6和TNF-α誘導的β-catenin核內(nèi)分布增多以及Wnt通路活化（相對熒光素酶活性Caco-2細胞系IL-63.297±0.1610vs2

6、.527±0.03323,p=0.0221;TNF-α4.130±0.4289vs2.780±0.3092,p=0.0249;HCT116細胞系IL-61.357±0.03422vs1.086±0.07545,p=0.0048;TNF-α2.374±0.1955vs1.802±0.06163,p=0.0313)。
　　結(jié)論:在Caco-2和HCT-116細胞系中，IL-6和TNF-α可能通過誘導NF-κB通路活化進一步促進CYP2

7、4A1表達量增加，促進核內(nèi)β-catenin增多，上調(diào)Wnt通路活化程度。
　　第二部分:潰瘍性結(jié)腸炎癌變模型小鼠中CYP24A1基因表達與炎癥因子的關(guān)系
　　目的:本實驗通過建立AOM聯(lián)合DSS小鼠UC癌變模型，給予阻斷炎癥因子TNF-α、NF-κB處理，探究炎癥相關(guān)途徑在UC癌變中對CYP24A1表達的影響。
　　方法:將C57BL/6小鼠隨機分為4組，第1組為空白對照組，第2-4組建立UC癌變小鼠模型（腹腔注射1

8、2.5mg/kg AOM，1周后給予2.5％DSS的飲用水，連續(xù)5天，之后換成普通飲用水），其中，第2組為模型對照組，第3組給予NF-κB反義寡聚核苷酸每兩周一次灌腸，第4組給予TNF-α單克隆抗體每兩周一次腹腔注射。12周后處死小鼠，統(tǒng)計瘤負荷，進行病理學評估，使用免疫組化方法檢測CYP24A1表達情況。
　　結(jié)果:CYP24A1表達在模型對照組（n=8，2.500±0.3273）中較空白組（n=6，1.167±0.1667）升

9、高(p=0.0067)。NF-κB反義寡聚核苷酸組的瘤負荷（n=5，1.130±0.1678cm）較模型對照組（n=8，2.294±0.3638cm）顯著下降，差異有統(tǒng)計學意義(p=0.0354);NF-κB反義寡聚核苷酸組的小鼠結(jié)腸上皮細胞中CYP24A1表達水平顯著下降(1.400±0.2449vs2.500±0.3273，p=0.0362)。TNF-α單克隆抗體組的瘤負荷（n=5，1.780±0.5142）較模型對照組（n=8，2