心肌慢性缺氧時(shí)MiR-17-5p調(diào)控STAT3信號通路意義的研究.pdf

1、隨著科技水平的日益發(fā)展，先天性心臟病的診斷和治療水平也大幅度提高。但是復(fù)雜性先天性心臟病仍然是一個(gè)難題，死亡率居高不下。其中最常見的就是紫紺型先天性心臟病。慢性缺氧是紫紺型先天性心臟病的共同的病理生理基礎(chǔ)，缺氧心肌細(xì)胞是如何完成從細(xì)胞信號傳導(dǎo)、蛋白合成到代謝的轉(zhuǎn)變，維持心肌細(xì)胞慢性缺氧代償性適應(yīng)，具體機(jī)制未完全研究清楚。因此，研究慢性缺氧條件下心肌細(xì)胞的適應(yīng)機(jī)制可能對于紫紺型先天性心臟病的治療和預(yù)后有所幫助。
　　miR-17-9

2、2基因簇為一種典型的含有多順反子啟動(dòng)子的高度保守的基因簇，位于人染色體13q31.3處，C13orf25基因第3個(gè)內(nèi)含子區(qū)，其轉(zhuǎn)錄前體包含了6個(gè)串聯(lián)的莖環(huán)發(fā)卡結(jié)構(gòu)，最終可產(chǎn)生miR-17，miR-18，miR-19a，miR-20，miR-19b和miR-92等6個(gè)成熟的miRNA。miR-17-92基因簇在腫瘤發(fā)生和肺、心臟、免疫器官的正常發(fā)育過程中都起著至關(guān)重要的作用。miR-17-5p屬于miR-17-92基因簇，定位于人染色體1

3、3q31，是一種編碼6個(gè)miRNA的多順反子性的miRNA。有研究發(fā)現(xiàn)，miR-17-5p通過STAT3信號通路來調(diào)控骨髓抑制細(xì)胞生長(MDSC)。最新研究發(fā)現(xiàn)，在心肌缺血再灌注小鼠模型和體外由H202誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激小鼠心肌細(xì)胞模型中，miR-17-5p表達(dá)增高，并且通過和STAT3的3'UTR結(jié)合，降低STAT3的表達(dá)，從而促進(jìn)心肌細(xì)胞的凋亡。
　　許多研究顯示，IL-6-JAK-STAT3信號通路在心臟病理、生理方面具有保護(hù)的

4、作用。之前我們的研究顯示，在心肌慢性缺氧過程中，NF-κB信號通路與SOCS3（STAT3自身誘導(dǎo)調(diào)節(jié)因子）所調(diào)控的IL-6/JAK2/STAT3信號通路的交互關(guān)系也影響著心肌傳導(dǎo)通路和心肌細(xì)胞的衰亡。因此，本實(shí)驗(yàn)主要探討心肌慢性缺氧環(huán)境下，miR-17-5p和STAT3的表達(dá)變化以及miR-17-5p對STAT3的調(diào)控對于缺氧心肌細(xì)胞凋亡的影響。
　　研究目的:
　　本實(shí)驗(yàn)擬在臨床心肌標(biāo)本和H9c2心肌細(xì)胞兩個(gè)水平檢測慢性

5、缺氧條件下miR-17-5p的表達(dá)變化。在H9c2心肌細(xì)胞慢性缺氧模型中使用抑制劑和增強(qiáng)劑改變miR-17-5p的表達(dá)，檢測改變miR-17-5p表達(dá)對STAT3及其下游靶基因c-myc的影響，從而對缺氧H9c2心肌細(xì)胞的影響。
　　研究方法:
　　1.研究臨床心肌標(biāo)本和H9c2心肌細(xì)胞兩個(gè)水平缺氧對miR-17-5p表達(dá)影響。
　　1.1收集人心肌標(biāo)本，紫紺組病人患有法洛四聯(lián)癥，非紫紺組病人患有右室流出道狹窄合并室間

6、隔缺損，標(biāo)本于手術(shù)中取自右室流出道。提取組織RNA，采用RT-PCR檢測miR-17-5p在兩組病人標(biāo)本中的表達(dá)情況。
　　1.2將同一批次H9c2(大鼠心室肌細(xì)胞系)細(xì)胞置于低氧培養(yǎng)箱(1.0％ O2、5.0％ CO2)中分別培養(yǎng)0h、12h、24h、48h及72h，對照組置于普通培養(yǎng)箱(21.0％ O2)中培養(yǎng)，利用RT-PCR技術(shù)檢測在心肌細(xì)胞系中隨著缺氧時(shí)間的延長miR-17-5p表達(dá)情況。
　　2.研究miR-17

7、-5p在H9c2細(xì)胞慢性缺氧中的作用及對STAT3信號通路的調(diào)控機(jī)制:
　　2.1常氧時(shí)在H9c2細(xì)胞系中轉(zhuǎn)染帶綠色熒光的陰性對照，通過熒光顯微鏡觀測轉(zhuǎn)染效率。
　　2.2向H9c2細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染agomir、antagomir和NC，建立agomir組、antagomir組、對照組和空白組。
　　2.3將轉(zhuǎn)染后的心肌細(xì)胞及空白組常氧培養(yǎng)24 h后(n=4)，再缺氧培養(yǎng)48 h，通過TUNEL檢測法檢測各組心肌細(xì)胞的凋亡

8、情況。
　　2.4 CCK8試劑檢測缺氧0h、12h、24 h、48 h各組心肌細(xì)胞的增殖情況。
　　2.5 TUNEL實(shí)驗(yàn)檢測缺氧48h后各組心肌細(xì)胞的凋亡情況。
　　2.6 Western Blot檢測缺氧48h后各組心肌細(xì)胞內(nèi)STAT3、p-Tyr-705-STAT3及其下游調(diào)控蛋白c-myc蛋白含量。
　　研究結(jié)果:
　　1.與非紫紺組(0.482±0.163)相比，紫紺組(1.45±0.705)患

9、兒心肌組織中miR-17-5p表達(dá)明顯升高(P＜0.01)。
　　2.在慢性缺氧中培養(yǎng)H9c2心肌細(xì)胞，RT-PCR結(jié)果顯示慢性缺氧0h(0.933±0.115)、12h(1.802±0.130)、24h(1.973±0.140)、48h(2.030±0.134)及72h(2.113±0.220)時(shí)H9c2細(xì)胞miR-17-5p表達(dá)逐漸增高(P＜0.01)。
　　3.將antagomir熒光陰性對照轉(zhuǎn)染H9c2細(xì)胞，熒光顯微

10、鏡觀測結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染效率達(dá)到75％以上。
　　4.CCK8實(shí)驗(yàn)檢測結(jié)果顯示，缺氧0h，6h，24h，48h后，和對照組相比，上調(diào)組大鼠H9c2心肌細(xì)胞增殖明顯減少(P＜0.01)，而下調(diào)組、空白組則無明顯差異(P＞0.05)
　　5.TUNEL實(shí)驗(yàn)檢測結(jié)果顯示，缺氧48h后，和對照組(0.1063±0.010969)相比，上調(diào)組(0.1599±0.02016)大鼠H9c2心肌細(xì)胞明顯凋亡增加(P＜0.01)，而下調(diào)組(0.09

11、41±0.01913)、空白組(0.0948±0.013286)則無明顯差異(P＞0.05)
　　6.miR-17-5p過表達(dá)的大鼠H9c2心肌細(xì)胞缺氧48h后，與對照組及空白組相比，STAT3，p-Tyr-705-STAT3及其下游調(diào)控蛋白c-myc的表達(dá)下降(P＜0.01);而miR-17-5p抑制的大鼠H9c2心肌細(xì)胞缺氧48h后，與對照組及空白組相比，STAT3，p-Tyr-705-STAT3及其下游調(diào)控蛋白c-myc的表

12、達(dá)無明顯改變(P＞0.05)。
　　研究結(jié)論:
　　1.與非紫紺型患者相比，紫紺型患者心肌標(biāo)本中miR-17-5p升高3倍左右。
　　2.H9c2心肌細(xì)胞慢性缺氧時(shí)，細(xì)胞中miR-17-5p表達(dá)逐漸升高。
　　3.H9c2心肌細(xì)胞慢性缺氧時(shí)，miR-17-5p過高表達(dá)對于STAT3信號通路有明顯的抑制作用，促進(jìn)心肌凋亡，減少增生。miR-17-5p的抑制對于STAT3信號通路無明顯的改變，對心肌凋亡和心肌增生無明