組織型轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶在日本血吸蟲感染所致肝纖維化及肺癌耐藥合并轉(zhuǎn)移中的作用.pdf

1、研究背景與目的：
　　組織型轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(tissue transglutaminase，tTG)是轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶家族中的一種多功能蛋白酶，分子量為80kDa，它作為鈣離子依賴酶，能夠催化蛋白質(zhì)的谷氨酰胺殘基與賴氨酸殘基交聯(lián)；能夠結(jié)合、水解GTP參與細(xì)胞內(nèi)外信號轉(zhuǎn)導(dǎo)；也可作為支架蛋白結(jié)合整合素、纖連蛋白等；或發(fā)揮蛋白激酶、蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶的作用。已有研究發(fā)現(xiàn)tTG與傷口愈合與修復(fù)、細(xì)胞凋亡、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞周期調(diào)控以及纖維化和癌癥等

2、多種生理病理過程相關(guān)。本研究旨在研究tTG在日本血吸蟲感染所致肝纖維化及肺癌耐藥合并轉(zhuǎn)移中的作用。
　　研究方法：
　　（1）實驗動物及日本血吸蟲感染致肝纖維化動物模型的建立 SPF級雌性BALB/c小鼠70只，6~8周齡，隨機分成正常對照組（10只）與實驗組（60只）。實驗組隨機取其中50只鼠，每只鼠經(jīng)腹部皮膚貼片法感染日本血吸蟲尾蚴20?3條，于感染后5、6、8和12周分別剖殺10只，另10只鼠感染3天后經(jīng)腹腔注射tTG

3、抑制劑胱胺（cystamine，CTM），100μl/只，濃度10-2mmol/L,每天一次，連續(xù)給藥7天，于感染后8周剖殺，同時設(shè)立未感染CTM治療組（10只）。
　?。?）動物標(biāo)本的處理收集對照組及各實驗組小鼠肝組織及血清。血清-20℃保存待用。肝組織一部分用于 RNA和蛋白提取，一部分用于制備石蠟切片。
　?。?）肺癌細(xì)胞株的處理收集A549肺癌細(xì)胞株和耐受順鉑的A549肺癌細(xì)胞株(A549-cisplatinum-r

4、esistance，A549-CDDPR)，分別提取RNA和制備細(xì)胞裂解液。對A549-CDDPR,用tTG小干擾RNA(Small interfering RNA，siRNA)轉(zhuǎn)染,陰性對照（NC）siRNA轉(zhuǎn)染作為對照。
　?。?）實驗方法用Masson染色法檢測肝臟膠原的多少；應(yīng)用免疫組化、逆轉(zhuǎn)錄PCR、熒光定量PCR和Western Blot檢測肝組織內(nèi)α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-S

5、MA）、tTG、轉(zhuǎn)化生長因子-β1（Transforming growth factorβ1，TGF-β1）和白細(xì)胞介素（interleukin，IL）13的表達(dá)水平；酶聯(lián)免疫吸附試驗(Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)檢測血清中TGF-β1和IL-13濃度；應(yīng)用熒光定量PCR和Western Blot及細(xì)胞免疫熒光法檢測各肺癌細(xì)胞株tTG的表達(dá)；免疫組化檢測人肺癌組織芯片tTG的表達(dá)；Tr

6、answell法（不加/加 matrigel）分別檢測肺癌細(xì)胞的遷移力和侵襲力；MTS法檢測肺癌細(xì)胞的存活。
　　研究結(jié)果：
　?。?）日本血吸蟲感染后第5、6、8周肝臟膠原面積逐漸增大、肝星狀細(xì)胞表達(dá)α-SMA逐漸增多，第8周最嚴(yán)重，相對于第8周，第12周膠原面積變小，α-SMA陽性表達(dá)降低。相對于未感染組，感染后5、6、8、12周小鼠肝組織內(nèi)tTG表達(dá)增加，且主要表達(dá)在肝內(nèi)門脈系統(tǒng)周圍細(xì)胞以及蟲卵肉芽腫、纖維組織及其周圍

7、肝細(xì)胞及炎性細(xì)胞浸潤區(qū)域；tTG抑制劑CTM處理后，日本血吸蟲感染8w小鼠肝臟膠原面積顯著減少，α-SMA陽性表達(dá)降低。血吸蟲感染后5、6、8、12周小鼠血清和肝臟局部TGF-β1蛋白表達(dá)水平升高，但小鼠TGF-β1的RNA表達(dá)水平下降，日本血吸蟲TGF-β1 RNA表達(dá)水平上升；tTG抑制劑CTM治療后，血清和肝臟TGF-β1蛋白表達(dá)水平下降。血吸蟲感染后5、6、8、12周小鼠血清和肝臟局部IL-13水平升高，tTG抑制劑CTM治療后

8、，IL-13總RNA表達(dá)水平下降，血清中IL-13水平下降，肝臟IL-13表達(dá)減少。
　　（2）順鉑對A549和A549-CDDPR的半數(shù)抑癌濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）分別為1.40ug/μl、36.67μg/μl；20×光學(xué)顯微鏡下A549、A549-CDDPR細(xì)胞遷移平均數(shù)分別為44.6±5.3個、229.67±27.34個，細(xì)胞侵襲平均數(shù)分別為55.33±5.

9、96個、359.0±36.87個， P<0.05，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。A549-CDDPR細(xì)胞的tTG水平明顯高于A549，P<0.05，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；人肺癌組織芯片免疫組化檢測提示有淋巴結(jié)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移患者肺癌組織tTG陽性表達(dá)率為72.4％，高于無轉(zhuǎn)移患者（陽性表達(dá)率37.6%），P<0.01，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義。tTG-siRNA下調(diào)A549-CDDPR細(xì)胞株tTG的表達(dá)后，細(xì)胞存活率為50.94±5.59%，而NC-siRNA轉(zhuǎn)

10、染A549-CDDPR細(xì)胞的存活率為92.60±5.32%，P<0.01，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義；20×光學(xué)顯微鏡下5個視野中，NC-siRNA處理A549-CDDPR細(xì)胞株、tTG-siRNA轉(zhuǎn)染A549-CDDPR細(xì)胞株平均遷移數(shù)分別為200.8±24.43個、103±13.10個，細(xì)胞平均侵襲數(shù)分別為337±22.2個、114.6±15.24個，P<0.05，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)論：
　　第一部分
　　（1）

11、日本血吸蟲感染后第5周小鼠肝臟出現(xiàn)少量纖維化，隨后纖維化逐漸加重，第8周纖維化最嚴(yán)重，感染后第12周已進入慢性肝纖維化期。
　?。?）日本血吸蟲感染后，tTG水平隨肝纖維化程度加重而升高，tTG抑制劑-胱胺（CTM）可以抑制日本血吸蟲感染所致的肝纖維化；因此tTG在日本血吸蟲感染所致肝纖維化中起重要作用。
　　（3）日本血吸蟲感染后，TGF-β1水平與肝纖維化程度呈正相關(guān)，日本血吸蟲源性 TGF-β1的高轉(zhuǎn)錄可能是日本血吸蟲

12、感染后肝臟和血液中高 TGF-β1的成因。
　?。?）日本血吸蟲感染后，IL-13水平與肝纖維化程度呈正相關(guān)。
　?。?） tTG可能通過調(diào)控TGF-β1和IL-13的水平，進而在日本血吸蟲肝纖維化中起作用。
　　第二部分
　?。?） A549順鉑耐藥細(xì)胞株（A549-CDDPR）相比于A549，不僅耐受高濃度的順鉑，而且具有高的遷移力和侵襲力；
　?。?） tTG表達(dá)與肺癌患者的轉(zhuǎn)移發(fā)生呈正相關(guān)；