β酪啡肽在大鼠胃腸道內(nèi)的釋放、吸收和穩(wěn)定特性及其對胃腸機能的影響.pdf

1、本文采用β酪啡肽(β CMs)的RP-HPLC分析方法，系統(tǒng)探索其在大鼠胃腸道內(nèi)的釋放、吸收和代謝特性以及經(jīng)胃腸道內(nèi)灌注后對小腸內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)(葡萄糖和氨基酸)吸收的影響；結(jié)合RT-PCR、原位雜交和免疫組化等技術(shù)，研究了D CMs對胃腸主要內(nèi)分泌激素——胃泌素(GAS)、生長抑素(SS)和膽囊收縮素(CCK)的分泌和基因表達(dá)的影響，并在此基礎(chǔ)上探討了其對胃腸內(nèi)分泌激素調(diào)節(jié)的可能作用機制，深化了對β CMs生物學(xué)功能(尤其是胃腸機能)的認(rèn)識

2、，為其新功能研究開發(fā)提供實驗依據(jù)。 1.大鼠胃腸食糜中CMs的釋放及其定量分析 本實驗采用β CMs的RH-HPLC分析方法，觀察了其在胃腸道內(nèi)的釋放特性。實驗包括2個部分。(1)以0.1％H<,3>PO<,4>/乙腈：水(3： 1)和0.1％H<,3>PO<,4>水溶液為流動相，線性梯度洗脫， 215nm檢測。β CM5和β CM 7的保留時間分別為2.64min和7.43min，在2-50μg/mL濃度范圍內(nèi)具有良好

3、的濃度-峰面積線性關(guān)系，理論檢測下限(Signal/Noise≥3)分別為35ng/mL，和83.3ng/mL，靈敏度高。β CM5和β CM7在胃腸食糜中平均回收率分別高達(dá)99.1％，97.3％和97.2％，93.9％。(2)12只剛斷奶大鼠均分為對照組和實驗組，自由采食基礎(chǔ)日糧。對照組和實驗組大鼠分別飲用純凈水和奶粉水溶液(200 mg/mL)。飼養(yǎng)4天后同時宰殺，采集胃和十二指腸食糜。飲水組的大鼠食糜中未能檢測到β CM5和β C

4、M7，而奶粉處理組的大鼠胃腸食糜中均檢測到βCM5和β CM7，其平均含量分別為0.556±0.064μg/g，0.548±0.09μg/g胃食糜和0.441±0.030μg/g，0.144±0.07μg/g腸食糜。結(jié)果表明，乳蛋白能在大鼠胃腸道內(nèi)釋放出β CM5和β CM7。胃是β CMs的主要釋放部位。 2.βCM7在成年大鼠胃和小腸內(nèi)的吸收特性研究 本實驗采用體外胃囊、腸囊吸收和體內(nèi)阻斷吸收技術(shù)，觀察了β CM7在

5、成年大鼠胃和小腸內(nèi)的吸收特性。實驗包括體內(nèi)和體外兩個部分。(1)將成年大鼠胃和空腸中上段取出，制備成黏膜面外翻的囊腔，放入含有β CM7的培養(yǎng)液中，觀察囊腔內(nèi)β CM7含量的變化。(2)采用結(jié)扎消化道吸收血管(胃和十二指腸上覆蓋的網(wǎng)膜)的方法，建立阻斷吸收模型。在可吸收和阻斷吸收兩種狀態(tài)下，比較分析了腔內(nèi)灌注β CM7的濃度變化，定性判斷其在胃和十二指腸內(nèi)的吸收特性。結(jié)果顯示，成年大鼠離體胃囊宗亞峰：β酪啡肽在大鼠胃腸道內(nèi)的釋放、吸收和

6、穩(wěn)定特性及其對胃腸機能的影響和腸囊腔內(nèi)均未能檢測到β CM7；在可吸收和阻斷吸收兩種狀態(tài)下，胃和十二指腸內(nèi)灌注的β CM7濃度在各個時間點差異不顯著；與起始濃度相比，各個時間點的βCM7濃度變化率差異也不顯著。體內(nèi)外的實驗結(jié)果表明，β CM7不能被成年大鼠胃和小腸粘膜吸收。 3.βCM7在胃和小腸內(nèi)的穩(wěn)定性研究 本實驗研究了胃腸黏膜和主要蛋白酶對β CM7穩(wěn)定性的影響，初步分析了其酶解產(chǎn)物的組成。(1)體外酶解實驗結(jié)果顯

7、示，在胃蛋白酶、胰蛋白酶、羧基肽酶A和氨基肽酶的酶解體系中，β CM7濃度沒有顯著變化；而二肽基肽酶作用10min，β CM7濃度下降了75.45％。與十二指腸黏膜對β CM7的降解速度相比，二肽酶的降解效應(yīng)占腸道粘膜降解作用的83.19％。(2)酶解產(chǎn)物的色譜結(jié)果顯示，β CM7在二肽基肽酶作用下能釋放更小短肽和氨基酸，其中含有，Tyr、Ile和β CM5。由此推斷：β CM7能在胃內(nèi)以完整的7肽結(jié)構(gòu)存在；小腸是其在體內(nèi)的首要代謝部位

8、，二肽基肽酶是其在腸道內(nèi)的主要降解酶；短肽是β CM7在腸道內(nèi)降解產(chǎn)物主要形式，β CM5是β CM7的腸道降解產(chǎn)物之一。 4.βCM7對大鼠胃內(nèi)胃泌素表達(dá)和分泌的影響及其機制探討 本實驗探討了β CM7對胃粘膜中胃泌素基因表達(dá)和分泌的影響及其調(diào)節(jié)機制。實驗分為兩個系列。(1)48只成年雄性SD大鼠隨機為6個處理組，分別灌喂1.5 mL生理鹽水、2.5×10<'-4>mol/L NaL、2.5×10<'-4>mol/L

9、β CM7、5×10<'-4> mol/L β CM7+5×10<'-4>mol/LNaL、2.5×10<'-4>mol/L β CM5、5×10<'-4> mol/L βCM5+5×10<'-4>mol/L，LNaL。每天灌喂兩次，30天后宰殺大鼠，刮取胃粘膜。RT-PcR法檢測大鼠胃粘膜中GAS和SSmRNA表達(dá)的變化。結(jié)果顯示：持續(xù)灌喂β CM7 30天后，大鼠胃粘膜中GAS mRNA表達(dá)顯著上升52.9％。將NaL(非特異性阿片

10、肽受體阻斷劑)與β CM7共同灌喂，GAS mRNA的表達(dá)與β CM7組相比下降29.2％，差異不顯著(P=0.15)。表明β CM7促GAS基因表達(dá)的效應(yīng)不能被NaL逆轉(zhuǎn)。具有更強阿片樣活性的β CM5雖然顯著刺激胃黏膜GAS基因表達(dá)，但與β CM7處理組相比差異不顯著。β CM7和β CM5均顯著降低大鼠胃粘膜中SS mRNA表達(dá)，兩個處理組之間沒有顯著差異。由此推斷，β CM7促GAS基因表達(dá)效應(yīng)與其非阿片樣活性和SS的反饋性調(diào)節(jié)

11、有關(guān)。(2)24只成年雄性SD大鼠隨機分為3個處理組，分別灌喂1.5 mL生理鹽水、2.5×10<'-4>mol/L β CM7、0.5×10<'-4> mol/L 7肽Poly-Gly(含氮量與D CM7相同)。連續(xù)灌喂30天后宰殺，以胃大彎為中軸線，刮取左側(cè)胃黏膜，固定右側(cè)胃組織。采用RT-PCR、原位雜交和免疫組化技術(shù)，觀察了β CM7對胃粘膜中GA-S和SS mRNA表達(dá)和分泌細(xì)胞的影響。灌喂β CM7顯著刺激胃黏膜內(nèi)GAS m

12、RNA表達(dá)，基因表達(dá)量上升52.8％；7肽Poly-Gly雖然也能上調(diào)胃黏膜內(nèi)GAS mRNA表達(dá)水平，但差異不顯著(P=0.15)。β CM7還能顯著下調(diào)黏膜中SS mRNA水平，抑制率達(dá)30.7％，而7肽Poly-Gly對SS基因水平?jīng)]有顯著影響。原位雜交結(jié)果顯示,β CM7處理組的大鼠胃底和胃竇黏膜內(nèi)GAS mRNA陽性細(xì)胞數(shù)分別顯著升高21.9％和17.5％。雖然βCM7處理組的大鼠胃底和胃竇黏膜中SSmRNA陽性細(xì)胞數(shù)沒有顯著

13、變化，但陽性細(xì)胞的平均灰度值分別顯著下降22.0％和19.5％。βCM7處理組和Poly-Gly處理組的大鼠胃竇黏膜中GAS mRNA陽性細(xì)胞的平均灰度值分別上升15.3％和22.5％．Poly-Gly處理組的大鼠胃黏膜中SS mRNA陽性細(xì)胞的個數(shù)和平均灰度值均沒有顯著變化。結(jié)果表明，β CM7對GAS基因表達(dá)和分泌的調(diào)節(jié)機制與其阿片樣活性和肽的營養(yǎng)刺激作用無關(guān)，而與SS旁分泌調(diào)節(jié)有關(guān)。作為胃內(nèi)穩(wěn)定存在的腔內(nèi)信號分子，β CM7表現(xiàn)了

14、其非阿片肽調(diào)節(jié)效應(yīng)和肽結(jié)構(gòu)效應(yīng)． 5.βCMs對大鼠十二指腸內(nèi)的膽囊收縮素表達(dá)的影響 48只成年雄性SD大鼠隨機為6個處理組，分別灌喂1.5 mL生理鹽水、2.5×10<'-4>mol/L，NaL、2.5×10<'-4> mol/L β CM7、5×10<'-4>mol/L β CM7+5×10<'-4> mol/L NaL、2.5×10<'-4>mol/L βD CM5、5×10<'-4> mol/L β CM5+5×

15、10<'-4>mol/L NaL。記錄周采食量。每天灌喂兩次，30天后宰殺大鼠，取十二指腸黏膜。RT-PCR法檢測腸粘膜中SS和CCKmRNA表達(dá)的變化。結(jié)果表明：βCMs調(diào)節(jié)大鼠短期采食。具有阿片樣活性的β CMs對十二指腸黏膜CCK基因表達(dá)的促進(jìn)效應(yīng)不僅僅與內(nèi)源性阿片肽系統(tǒng)有關(guān)，還與十二指腸黏膜中SS反饋調(diào)節(jié)有關(guān)。 6.βCMs對小腸葡萄糖和氨基酸吸收的影響 本實驗觀察了β CMs對成年大鼠血糖和氨基酸水平及其對小腸

16、葡萄糖和氨基酸宗亞峰：β酪啡肽在大鼠胃腸道內(nèi)的釋放、吸收和穩(wěn)定特性及其對胃腸機能的影響吸收的影響。實驗分為體內(nèi)和體外兩個部分．32只成年雄性SD大鼠隨機分為4個處理組，分別灌喂1.5 mL生理鹽水、2.5×10<'-4> mol/L β CM7、2.5×10<'-4>mol/L β CM5和0.5×10<'-4>mol/L Poly-Gly7(與β CM7的含氮量相同)。連續(xù)灌喂30天后宰殺大鼠，取血清，測定血清中葡萄糖和氨基酸含量。體

17、外實驗分別探討0、62.5、125和25μg/mLβ CM7對離體腸囊葡萄糖和氨基酸吸收的影響。將成年大鼠空腸中上段取出，制備成黏膜面外翻的腸囊，放入含有上述不同濃度的β CM7和葡萄糖、β CM7和氨基酸的培養(yǎng)液中，觀察腸囊內(nèi)葡萄糖和氨基酸含量的動態(tài)變化。結(jié)果表明，βCM7通過降低葡萄糖吸收的平均速度，抑制小腸對葡萄糖的吸收，從而影響了機體的血糖水平。βCM7對小腸氨基酸吸收的影響與其對氨基酸吸收早期的平均速度和刺激吸收的時間以及βC