β酪啡肽在大鼠胃腸道內(nèi)的釋放、吸收和穩(wěn)定特性及其對(duì)胃腸機(jī)能的影響.pdf

1、本文采用β酪啡肽(β CMs)的RP-HPLC分析方法，系統(tǒng)探索其在大鼠胃腸道內(nèi)的釋放、吸收和代謝特性以及經(jīng)胃腸道內(nèi)灌注后對(duì)小腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)(葡萄糖和氨基酸)吸收的影響；結(jié)合RT-PCR、原位雜交和免疫組化等技術(shù)，研究了D CMs對(duì)胃腸主要內(nèi)分泌激素——胃泌素(GAS)、生長(zhǎng)抑素(SS)和膽囊收縮素(CCK)的分泌和基因表達(dá)的影響，并在此基礎(chǔ)上探討了其對(duì)胃腸內(nèi)分泌激素調(diào)節(jié)的可能作用機(jī)制，深化了對(duì)β CMs生物學(xué)功能(尤其是胃腸機(jī)能)的認(rèn)識(shí)

2、，為其新功能研究開(kāi)發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 1.大鼠胃腸食糜中CMs的釋放及其定量分析 本實(shí)驗(yàn)采用β CMs的RH-HPLC分析方法，觀(guān)察了其在胃腸道內(nèi)的釋放特性。實(shí)驗(yàn)包括2個(gè)部分。(1)以0.1％H<,3>PO<,4>/乙腈：水(3： 1)和0.1％H<,3>PO<,4>水溶液為流動(dòng)相，線(xiàn)性梯度洗脫， 215nm檢測(cè)。β CM5和β CM 7的保留時(shí)間分別為2.64min和7.43min，在2-50μg/mL濃度范圍內(nèi)具有良好

3、的濃度-峰面積線(xiàn)性關(guān)系，理論檢測(cè)下限(Signal/Noise≥3)分別為35ng/mL，和83.3ng/mL，靈敏度高。β CM5和β CM7在胃腸食糜中平均回收率分別高達(dá)99.1％，97.3％和97.2％，93.9％。(2)12只剛斷奶大鼠均分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，自由采食基礎(chǔ)日糧。對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組大鼠分別飲用純凈水和奶粉水溶液(200 mg/mL)。飼養(yǎng)4天后同時(shí)宰殺，采集胃和十二指腸食糜。飲水組的大鼠食糜中未能檢測(cè)到β CM5和β C

4、M7，而奶粉處理組的大鼠胃腸食糜中均檢測(cè)到βCM5和β CM7，其平均含量分別為0.556±0.064μg/g，0.548±0.09μg/g胃食糜和0.441±0.030μg/g，0.144±0.07μg/g腸食糜。結(jié)果表明，乳蛋白能在大鼠胃腸道內(nèi)釋放出β CM5和β CM7。胃是β CMs的主要釋放部位。 2.βCM7在成年大鼠胃和小腸內(nèi)的吸收特性研究 本實(shí)驗(yàn)采用體外胃囊、腸囊吸收和體內(nèi)阻斷吸收技術(shù)，觀(guān)察了β CM7在

5、成年大鼠胃和小腸內(nèi)的吸收特性。實(shí)驗(yàn)包括體內(nèi)和體外兩個(gè)部分。(1)將成年大鼠胃和空腸中上段取出，制備成黏膜面外翻的囊腔，放入含有β CM7的培養(yǎng)液中，觀(guān)察囊腔內(nèi)β CM7含量的變化。(2)采用結(jié)扎消化道吸收血管(胃和十二指腸上覆蓋的網(wǎng)膜)的方法，建立阻斷吸收模型。在可吸收和阻斷吸收兩種狀態(tài)下，比較分析了腔內(nèi)灌注β CM7的濃度變化，定性判斷其在胃和十二指腸內(nèi)的吸收特性。結(jié)果顯示，成年大鼠離體胃囊宗亞峰：β酪啡肽在大鼠胃腸道內(nèi)的釋放、吸收和

6、穩(wěn)定特性及其對(duì)胃腸機(jī)能的影響和腸囊腔內(nèi)均未能檢測(cè)到β CM7；在可吸收和阻斷吸收兩種狀態(tài)下，胃和十二指腸內(nèi)灌注的β CM7濃度在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)差異不顯著；與起始濃度相比，各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的βCM7濃度變化率差異也不顯著。體內(nèi)外的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，β CM7不能被成年大鼠胃和小腸粘膜吸收。 3.βCM7在胃和小腸內(nèi)的穩(wěn)定性研究 本實(shí)驗(yàn)研究了胃腸黏膜和主要蛋白酶對(duì)β CM7穩(wěn)定性的影響，初步分析了其酶解產(chǎn)物的組成。(1)體外酶解實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯

7、示，在胃蛋白酶、胰蛋白酶、羧基肽酶A和氨基肽酶的酶解體系中，β CM7濃度沒(méi)有顯著變化；而二肽基肽酶作用10min，β CM7濃度下降了75.45％。與十二指腸黏膜對(duì)β CM7的降解速度相比，二肽酶的降解效應(yīng)占腸道粘膜降解作用的83.19％。(2)酶解產(chǎn)物的色譜結(jié)果顯示，β CM7在二肽基肽酶作用下能釋放更小短肽和氨基酸，其中含有，Tyr、Ile和β CM5。由此推斷：β CM7能在胃內(nèi)以完整的7肽結(jié)構(gòu)存在；小腸是其在體內(nèi)的首要代謝部位

8、，二肽基肽酶是其在腸道內(nèi)的主要降解酶；短肽是β CM7在腸道內(nèi)降解產(chǎn)物主要形式，β CM5是β CM7的腸道降解產(chǎn)物之一。 4.βCM7對(duì)大鼠胃內(nèi)胃泌素表達(dá)和分泌的影響及其機(jī)制探討 本實(shí)驗(yàn)探討了β CM7對(duì)胃粘膜中胃泌素基因表達(dá)和分泌的影響及其調(diào)節(jié)機(jī)制。實(shí)驗(yàn)分為兩個(gè)系列。(1)48只成年雄性SD大鼠隨機(jī)為6個(gè)處理組，分別灌喂1.5 mL生理鹽水、2.5×10<'-4>mol/L NaL、2.5×10<'-4>mol/L

9、β CM7、5×10<'-4> mol/L β CM7+5×10<'-4>mol/LNaL、2.5×10<'-4>mol/L β CM5、5×10<'-4> mol/L βCM5+5×10<'-4>mol/L，LNaL。每天灌喂兩次，30天后宰殺大鼠，刮取胃粘膜。RT-PcR法檢測(cè)大鼠胃粘膜中GAS和SSmRNA表達(dá)的變化。結(jié)果顯示：持續(xù)灌喂β CM7 30天后，大鼠胃粘膜中GAS mRNA表達(dá)顯著上升52.9％。將NaL(非特異性阿片

10、肽受體阻斷劑)與β CM7共同灌喂，GAS mRNA的表達(dá)與β CM7組相比下降29.2％，差異不顯著(P=0.15)。表明β CM7促GAS基因表達(dá)的效應(yīng)不能被NaL逆轉(zhuǎn)。具有更強(qiáng)阿片樣活性的β CM5雖然顯著刺激胃黏膜GAS基因表達(dá)，但與β CM7處理組相比差異不顯著。β CM7和β CM5均顯著降低大鼠胃粘膜中SS mRNA表達(dá)，兩個(gè)處理組之間沒(méi)有顯著差異。由此推斷，β CM7促GAS基因表達(dá)效應(yīng)與其非阿片樣活性和SS的反饋性調(diào)節(jié)

11、有關(guān)。(2)24只成年雄性SD大鼠隨機(jī)分為3個(gè)處理組，分別灌喂1.5 mL生理鹽水、2.5×10<'-4>mol/L β CM7、0.5×10<'-4> mol/L 7肽Poly-Gly(含氮量與D CM7相同)。連續(xù)灌喂30天后宰殺，以胃大彎為中軸線(xiàn)，刮取左側(cè)胃黏膜，固定右側(cè)胃組織。采用RT-PCR、原位雜交和免疫組化技術(shù)，觀(guān)察了β CM7對(duì)胃粘膜中GA-S和SS mRNA表達(dá)和分泌細(xì)胞的影響。灌喂β CM7顯著刺激胃黏膜內(nèi)GAS m

12、RNA表達(dá)，基因表達(dá)量上升52.8％；7肽Poly-Gly雖然也能上調(diào)胃黏膜內(nèi)GAS mRNA表達(dá)水平，但差異不顯著(P=0.15)。β CM7還能顯著下調(diào)黏膜中SS mRNA水平，抑制率達(dá)30.7％，而7肽Poly-Gly對(duì)SS基因水平?jīng)]有顯著影響。原位雜交結(jié)果顯示,β CM7處理組的大鼠胃底和胃竇黏膜內(nèi)GAS mRNA陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)分別顯著升高21.9％和17.5％。雖然βCM7處理組的大鼠胃底和胃竇黏膜中SSmRNA陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)沒(méi)有顯著

13、變化，但陽(yáng)性細(xì)胞的平均灰度值分別顯著下降22.0％和19.5％。βCM7處理組和Poly-Gly處理組的大鼠胃竇黏膜中GAS mRNA陽(yáng)性細(xì)胞的平均灰度值分別上升15.3％和22.5％．Poly-Gly處理組的大鼠胃黏膜中SS mRNA陽(yáng)性細(xì)胞的個(gè)數(shù)和平均灰度值均沒(méi)有顯著變化。結(jié)果表明，β CM7對(duì)GAS基因表達(dá)和分泌的調(diào)節(jié)機(jī)制與其阿片樣活性和肽的營(yíng)養(yǎng)刺激作用無(wú)關(guān)，而與SS旁分泌調(diào)節(jié)有關(guān)。作為胃內(nèi)穩(wěn)定存在的腔內(nèi)信號(hào)分子，β CM7表現(xiàn)了

14、其非阿片肽調(diào)節(jié)效應(yīng)和肽結(jié)構(gòu)效應(yīng)． 5.βCMs對(duì)大鼠十二指腸內(nèi)的膽囊收縮素表達(dá)的影響 48只成年雄性SD大鼠隨機(jī)為6個(gè)處理組，分別灌喂1.5 mL生理鹽水、2.5×10<'-4>mol/L，NaL、2.5×10<'-4> mol/L β CM7、5×10<'-4>mol/L β CM7+5×10<'-4> mol/L NaL、2.5×10<'-4>mol/L βD CM5、5×10<'-4> mol/L β CM5+5×

15、10<'-4>mol/L NaL。記錄周采食量。每天灌喂兩次，30天后宰殺大鼠，取十二指腸黏膜。RT-PCR法檢測(cè)腸粘膜中SS和CCKmRNA表達(dá)的變化。結(jié)果表明：βCMs調(diào)節(jié)大鼠短期采食。具有阿片樣活性的β CMs對(duì)十二指腸黏膜CCK基因表達(dá)的促進(jìn)效應(yīng)不僅僅與內(nèi)源性阿片肽系統(tǒng)有關(guān)，還與十二指腸黏膜中SS反饋調(diào)節(jié)有關(guān)。 6.βCMs對(duì)小腸葡萄糖和氨基酸吸收的影響 本實(shí)驗(yàn)觀(guān)察了β CMs對(duì)成年大鼠血糖和氨基酸水平及其對(duì)小腸

16、葡萄糖和氨基酸宗亞峰：β酪啡肽在大鼠胃腸道內(nèi)的釋放、吸收和穩(wěn)定特性及其對(duì)胃腸機(jī)能的影響吸收的影響。實(shí)驗(yàn)分為體內(nèi)和體外兩個(gè)部分．32只成年雄性SD大鼠隨機(jī)分為4個(gè)處理組，分別灌喂1.5 mL生理鹽水、2.5×10<'-4> mol/L β CM7、2.5×10<'-4>mol/L β CM5和0.5×10<'-4>mol/L Poly-Gly7(與β CM7的含氮量相同)。連續(xù)灌喂30天后宰殺大鼠，取血清，測(cè)定血清中葡萄糖和氨基酸含量。體

17、外實(shí)驗(yàn)分別探討0、62.5、125和25μg/mLβ CM7對(duì)離體腸囊葡萄糖和氨基酸吸收的影響。將成年大鼠空腸中上段取出，制備成黏膜面外翻的腸囊，放入含有上述不同濃度的β CM7和葡萄糖、β CM7和氨基酸的培養(yǎng)液中，觀(guān)察腸囊內(nèi)葡萄糖和氨基酸含量的動(dòng)態(tài)變化。結(jié)果表明，βCM7通過(guò)降低葡萄糖吸收的平均速度，抑制小腸對(duì)葡萄糖的吸收，從而影響了機(jī)體的血糖水平。βCM7對(duì)小腸氨基酸吸收的影響與其對(duì)氨基酸吸收早期的平均速度和刺激吸收的時(shí)間以及βC