孕期酒精暴露對子鼠小腦浦肯野細胞自噬影響的實驗性研究.pdf

1、細胞的自噬(autophagy)是近十年來生命科學領(lǐng)域一個新的研究熱點，它是繼凋亡(apoptosis)之后發(fā)現(xiàn)的另一種程序性細胞死亡方式。自噬現(xiàn)象可見于細胞正常的生長發(fā)育及其病理變化過程，在降解胞內(nèi)蛋白、蛋白結(jié)構(gòu)重建、清除廢物、保持細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定等方面發(fā)揮著非常重要的作用。在闡釋自噬發(fā)生機制方面，人們對于酒精的毒性作用與細胞自噬的關(guān)系，特別是對神經(jīng)元的影響研究較少。在胚胎發(fā)育的關(guān)鍵時期遭受宮內(nèi)酒精的暴露，會對胚胎神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育造成較為

2、嚴重的損害。本課題通過建立妊娠期酒精暴露動物模型，模擬胎兒酒精綜合征(Fetal Alcohol Syndrome，F(xiàn)AS)的發(fā)生，應(yīng)用透射電子顯微鏡、免疫細胞化學染色及Western blotting等技術(shù)，對孕期酒精暴露后不同年齡段的仔鼠小腦浦肯野(Purkinje)細胞自噬現(xiàn)象進行系統(tǒng)的研究，結(jié)果如下：
　　 1.孕期酒精暴露影響仔鼠小腦Purkinje細胞的發(fā)育;
　　 利用免疫細胞化學染色的方法，在對照組與模型

3、組間對P7～P30年齡段仔鼠的Purkinje細胞發(fā)育的一般形態(tài)進行比較，結(jié)果顯示酒精模型組較對照組Purkinje細胞在發(fā)育上存在著一般形態(tài)學上的差異，如皮質(zhì)層變薄、細胞胞體變小、細胞排列混亂、樹突分支減少、樹突棘密度降低等，特別是高劑量酒精組變化更明顯。這說明酒精暴露影響了子代小腦Purkinje細胞的發(fā)育，且有劑量依賴效應(yīng)。
　　 2.透射電子顯微鏡觀察證實孕期酒精暴露后Purkinje細胞自噬的發(fā)生;
　　 一直

4、以來，透射電子顯微鏡都是判斷自噬發(fā)生的金標準。我們利用透射電子顯微鏡技術(shù)，觀察對照組與模型組小腦Purkinje細胞胞質(zhì)內(nèi)微觀結(jié)構(gòu)變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：酒精暴露后Purkinje細胞自噬作用明顯增強。酒精模型組較對照組，特別是高劑量酒精組細胞胞質(zhì)內(nèi)，發(fā)現(xiàn)較多自噬體或自噬溶酶體樣結(jié)構(gòu)，并且其細胞器普遍存在如線粒體結(jié)構(gòu)腫脹、線粒體嵴受損，高爾基體扁平囊擴張、大小泡結(jié)構(gòu)崩解，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張等情況。這一結(jié)果從微觀結(jié)構(gòu)證實孕期酒精暴露對子代小腦Purk

5、inje細胞的發(fā)育產(chǎn)生不良影響，且誘導細胞自噬的發(fā)生。
　　 3.光鏡觀察和Western blotting蛋白檢測Purkinje細胞自噬情況比較;
　　 微管相關(guān)蛋白輕鏈3(MAPLC3)是編碼自噬相關(guān)蛋白的重要基因，它被認為是自噬體膜上標志性蛋白。本研究利用免疫細胞化學染色的方法，MAPLC3熒光單標、與Calbindin熒光雙標，光鏡下觀察Purkinje細胞自噬現(xiàn)象的發(fā)生，結(jié)果顯示：P7、P14模型組自噬細胞數(shù)

6、量(PAC)及自噬指數(shù)(PAI)明顯多于對照組，高劑量酒精組多于低劑量組(P＜0.01)；P30模型組與對照組間差別不明顯(P＞0.05)。對照組不同年齡點仔鼠隨著年齡的增長，PAC及PAI隨著年齡的增長逐漸增高(F=58.29，P＜0.001)。Western blotting支持了光鏡統(tǒng)計結(jié)果，半定量分析顯示差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。這樣的結(jié)果提示孕期酒精暴露能夠誘導Purkinje細胞自噬的發(fā)生，且有劑量依賴性和長時程效

7、應(yīng)。
　　 4.Beelin-1對細胞自噬影響的正調(diào)控作用;
　　 Beclin-1也是哺乳動物參與自噬的特異性基因，已經(jīng)證實在哺乳動物中Beclin-1表達的上調(diào)能夠刺激自噬的發(fā)生，是自噬重要的正調(diào)節(jié)因子。利用Beclin-1熒光單標、與MAPLC3熒光雙標、與Calbindin熒光雙標，結(jié)果顯示：Beclin-1在酒精模型組與對照組間的表達情況比較與MAPLC3基本一致，二者在同一細胞中幾乎呈重疊表達，MAPLC3在

8、細胞核內(nèi)僅有少量表達，Beclin-1不表達，也即是二者表達基本上成正相關(guān)。Western blot半定量分析支持光鏡統(tǒng)計結(jié)果，差異具有統(tǒng)計學意義。這一結(jié)果提示酒精暴露導致Purkinje細胞自噬作用增強可能是通過酒精的有效成分乙醇或者代謝產(chǎn)物乙醛刺激了Beclin-1表達的上調(diào)，激活了自噬其它相關(guān)基因如MAPLC3的表達。
　　 總之，自噬是大自然賦予生命體一種獨特的生理調(diào)節(jié)方式，在細胞更新?lián)Q代、抵御惡劣環(huán)境變化中起著非常重要