熱缺血再灌注損傷影響肝臟細胞周期調(diào)控基因的表達譜聚類分析及相關蛋白研究.pdf

1、隨著器官移植療效的提高，病例數(shù)逐年遞增，移植器官短缺日趨嚴重。在劈裂式肝移植、活體肝移植尚不成熟，異種移植、轉(zhuǎn)基因動物仍未取得實質(zhì)性進展之前，“邊緣”供體受到越來越多的重視。在我國供肝大多來自無心跳“邊緣’’供體，供肝切取時熱缺血再灌注損傷無法避免；另外，移植物恢復血流后膽道的溫缺血亦值得關注。同時熱缺血再灌注損傷也是肝膽外科手術各種肝門血流阻斷法應用下相當常見的問題。 觀察肝臟熱缺血再灌注損傷對細胞周期調(diào)控和組織細胞再生相關基

2、因表達的影響，篩選出與細胞周期檢查點密切相關的功能基因及相關蛋白，以探討熱缺血再灌注損傷的分子機制；為臨床防治熱缺血再灌注損傷提供實驗依據(jù)。 本實驗采用成組隨機對照的實驗設計，利用微陣列芯片和實時熒光定量PCR聯(lián)合分析技術，分析熱缺血再灌注損傷大鼠模型處理后的基因表達動態(tài)變化；按基因表達的動力學特征對功能基因進行多元變量聚類分析。針對目的蛋白Hsp70、Gadd45a，、Egrl、CyclinDl的westernblot半定量實

3、驗和免疫熒光組織化學進行細胞定位及時序研究。 發(fā)現(xiàn)在常溫熱缺血30min、再灌注1h和24h時間點，肝實質(zhì)細胞分別有86、410和234條基因上調(diào)其mRNA表達，下調(diào)的基因分別為136、312和653條。根據(jù)其表達動力學特征繪制出分級聚類分析樹形圖。熒光定量RT-PCR擴增分析細胞保護機制密切相關的基因如：Gadd45a，、Egr1、Hsp70，確認實驗結果與芯片檢測相一致。 Western blot半定量研究顯示Egr1蛋白在

4、熱缺血30m即有高表達，再灌注30m表達有所下降。Hsp70蛋白和CyclinD1蛋白在灌注早期保持高表達狀態(tài)。 免疫熒光染色和western blot蛋白研究方法顯示：Egr1蛋白在熱缺血30m即有高表達，再灌注30m-1h表達稍有下降，逐漸下降至處理前水平，符合早期即刻基因的表達特點。Gadd45a、Hsp70蛋白和CyclinD1蛋白在灌注早期1-3h保持高表達狀態(tài)。HSP70是細胞漿陽性，N時陰性，R1h和R2h時有灶性

5、弱陽性，R3h時強陽性，陽性細胞主要在肝小葉中央靜脈血管周圍；Cyclin D1為核陽性，N時即有部分陽性，R1-R24h的陽性變化不大；Egr-1冰凍切片顯示為核陽性，N時陰性，130'和R30'時均有個別細胞陽性，R1h和R2h時數(shù)量增多，總體陽性表達要稍低于Cyclin D1；GADD45為N(一)，其它均為灶性胞漿陽性，只有R1h時胞漿和核均陽性。 顯示在采用非致死性WIRI處理后，再灌注早期肝臟細胞周期調(diào)控基因相關基因