東海厚殼貽貝水溶性多糖MP-Ⅰ的結(jié)構(gòu)鑒定及生物學(xué)活性研究.pdf

1、多糖是一類廣泛存在于動(dòng)植物、微生物中的重要的生物大分子物質(zhì)。隨著分子生物學(xué)研究的不斷深入，人們逐漸發(fā)現(xiàn)不同來源的多糖具有廣泛而復(fù)雜的生物學(xué)活性，多糖的研究已引起了醫(yī)藥界的高度重視，并成為當(dāng)今生命科學(xué)研究的熱點(diǎn)之一。美國(guó)于2001年啟動(dòng)了“功能糖組學(xué)計(jì)劃”，日本也開展了“糖工程前沿計(jì)劃”，其整體目標(biāo)是闡明糖鏈的生物學(xué)功能，并設(shè)計(jì)出治療心血管疾病、癌癥、感染性疾病等多糖類藥物。我國(guó)對(duì)多糖類的研究起步較晚，但進(jìn)展迅速，尤其在多糖類的生物學(xué)功能

2、研究方面取得了較快的進(jìn)展。 海洋是生物多糖的一個(gè)重要來源地，隨著對(duì)陸地植物、真菌多糖的大量開發(fā)，海洋生物多糖也越來越引起人們的注意。目前海洋多糖的開發(fā)研究較多集中在海洋植物，多種海藻多糖的結(jié)構(gòu)得到了闡明并被發(fā)現(xiàn)具有增強(qiáng)機(jī)體免疫力、抗腫瘤、抗放射性、抗衰老等作用。而對(duì)海洋動(dòng)物多糖的相關(guān)研究報(bào)道則較少。 厚殼貽貝(Mytilus coruscus)屬于海洋軟體動(dòng)物門，雙殼綱，貽貝目，貽貝科，盛產(chǎn)于我國(guó)渤海、黃海等海域，在我國(guó)

3、北方稱海紅，江浙一帶稱淡菜。已有研究表明，貽貝提取物有抗腫瘤、抗衰老、抗病毒、抗酒精性肝損傷和抗菌的功能和增加機(jī)體免疫能力、降低血脂含量的功效。而多糖是其中重要的有效活性成分之一。 我室對(duì)海洋動(dòng)物多糖的研究已有多年的基礎(chǔ)，本文主要對(duì)東海厚殼貽貝多糖MP-Ⅰ(Mytilus coruscus polysaccharide MP-Ⅰ)進(jìn)行了分離純化、結(jié)構(gòu)鑒定及生物學(xué)活性研究。 1.MP-Ⅰ的分離純化。通過新鮮厚殼貽貝肉組織勻

4、漿、熱水抽提、水提液Sevag法除蛋白的方法得到多糖粗品。多糖粗品經(jīng)DEAE-Sepharose陰離子交換樹脂分離，Sepharose CL-6B凝膠反復(fù)純化。多糖的純度經(jīng)旋光度測(cè)定和高效液相色譜法(HPLC)檢測(cè)，HPLC法測(cè)定分子量。同時(shí)，對(duì)分離純化的條件進(jìn)行了優(yōu)化。 2.MP-Ⅰ的結(jié)構(gòu)鑒定。通過對(duì)MP-Ⅰ進(jìn)行紫外(200-400nm)掃描、紅外掃描、單糖組分測(cè)定(氣相色譜及硅膠薄層層析)、甲基化分析、高碘酸氧化分析、核磁共

5、振分析、糖醛酸含量測(cè)定、硫酸根含量測(cè)定，最終確定MP-Ⅰ的化學(xué)結(jié)構(gòu)。 3.MP-Ⅰ的生物學(xué)活性研究。(1)MP-Ⅰ抗小鼠急性肝損傷作用的研究。將昆明小鼠隨機(jī)分成6組：①正常組(生理鹽水+橄欖油)；②陰性對(duì)照組(生理鹽水+CCl<,4>橄欖油)；③陽性對(duì)照組(苦參素，30 mg·kg<'-1>·d<'-1>+CCl<,4>橄欖油)；④MP-Ⅰ高濃度組(MP-Ⅰ100 mg·kg<'-1>d<'-1>+CCl<,4>橄欖油)；⑤MP

6、-Ⅰ中濃度組(MP-Ⅰ 50 mg·kg<'-1>·d<'-1>+CCl<,4>橄欖油)；⑥MP-Ⅰ低濃度組(MP-Ⅰ 25 mg·kg<'-1>·d<'-1>+CCl<,4>橄欖油)。實(shí)驗(yàn)室常規(guī)飼養(yǎng)3 d后，各組小鼠腹腔注射不同藥物0.2ml/只：正常組和陰性對(duì)照組注射生理鹽水、陽性對(duì)照組注射苦參素、MP-Ⅰ三個(gè)組分別注射不同劑量的多糖。連續(xù)7d，末次注射2h后，空白對(duì)照組腹腔注射0.2ml/20g的橄欖油，其余各組腹腔注射0.2ml

7、/20g劑量的0.2％CCl<,4>橄欖油溶液，制備急性肝損傷模型。24h后各組小鼠眼眶取血，頸椎脫臼法處死后取肝，測(cè)定各組小鼠肝指數(shù)、血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)，肝組織勻漿超氧化物歧化酶(SOD)及丙二醛(MDA)水平。光鏡下觀察肝組織切片的病理學(xué)變化。(2)MP-Ⅰ對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用的研究。設(shè)立MP-Ⅰ三個(gè)濃度組(500pμg/ml、100μg/ml、20μg/ml)分別作用于體外培養(yǎng)的HO-8910、MCF

8、-7、K562、SMMC-7721、HL-60、Hela六種腫瘤細(xì)胞，MTT法測(cè)定不同濃度MP-Ⅰ對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，經(jīng)過分離純化后得到的貽貝多糖純品MP-Ⅰ為白色粉末，水溶性佳，分子量為1350KDa。經(jīng)分離純化條件的優(yōu)化，縮短了分離純化的時(shí)間，純多糖得率提高至貽貝鮮組織的2.14％。 結(jié)構(gòu)鑒定表明，MP-Ⅰ是以α-D-(1→4)Glc為主鏈，α-D-(1→6)Glc連接為側(cè)鏈的葡聚糖，其化學(xué)結(jié)構(gòu)

9、為： 抗小鼠急性肝損傷結(jié)果表明，MP-Ⅰ高濃度組(100 mg·kg<'-1>·d<'-1>)能顯著降低CCl<,4>急性肝損傷小鼠血清谷丙氨酸(ALT)、谷草氨酸(AST)水平(P<0.01)，降低肝組織丙二醛(MDA)水平(P<0.01)，增高肝組織超氧化物岐化酶(SOD)水平(P<0.01)。中濃度組(50 mg·kg<'-1>·d<'-1>)能顯著降低CCl<,4>急性肝損傷小鼠血清ALT(P<0.01)、AST水平(P

10、<0.05)，降低肝組織MDA水平(P<0.05)，增高肝組織SOD水平(P<0.01)。MP-Ⅰ低濃度組(25 mg·kg<'-1>·d<'-1>)能顯著降低CCl<,4>急性肝損傷小鼠血清ALT水平(P<0.01)，但對(duì)血清AST、肝組織MDA和SOD水平無顯著影響(P>0.05)。陽性對(duì)照組(30 mg·kg<'-1>·d<'-1>)能顯著降低CCl<,4>急性肝損傷小鼠血清AST水平(P<0.01)，降低肝組織MDA水平(P<0

11、.05)，增高肝組織SOD水平(P<0.05)，但對(duì)血清ALT水平并無顯著降低作用(P>0.05)。肝臟病理組織學(xué)顯示，MP-Ⅰ能明顯抵御肝損傷小鼠肝細(xì)胞壞死和炎癥細(xì)胞入侵，改善肝臟病理學(xué)損傷程度，且與劑量呈正相關(guān)。但各組小鼠的肝指數(shù)無顯著差異。體外抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)作用研究表明，MP-Ⅰ三個(gè)濃度組對(duì)體外HO-8910，MCF-7，K562，SMMC-7721四種腫瘤細(xì)胞均有不同程度的生長(zhǎng)抑制作用(P<0.01)，其中高濃度組對(duì)HO-89