組織工程支架材料及其降解產(chǎn)物血管化功能的體外研究及表征方法的建立.pdf

1、本論文課題來(lái)源為國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目“可降解生物材料與內(nèi)皮細(xì)胞界面反應(yīng)對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞功能蛋白表達(dá)的影響及機(jī)理研究”(No.30370411)。 理想的組織工程材料應(yīng)具有可控的生物降解性。要解決組織生長(zhǎng)和材料降解的匹配問(wèn)題，必須了解材料在使用中的生物學(xué)過(guò)程，并闡明材料降解與細(xì)胞生長(zhǎng)和組織構(gòu)建的相互作用機(jī)制。這是一個(gè)材料學(xué)與生命科學(xué)交叉的課題，也是生物材料研究中的難點(diǎn)。血管化問(wèn)題是組織工程取得成功的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，研究生物材料對(duì)組織血管化過(guò)程

2、的影響和機(jī)理，設(shè)計(jì)和開發(fā)促血管化的支架材料是組織工程對(duì)生物材料的挑戰(zhàn)。已有研究表明，材料的三維結(jié)構(gòu)和表面性質(zhì)可顯著影響血管形成，但材料降解產(chǎn)物會(huì)不會(huì)影響以及如何影響血管形成目前尚不清楚。 本論文針對(duì)以上問(wèn)題，借鑒醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究方法，建立了組織工程材料降解產(chǎn)物血管化功能的表征體系。在此基礎(chǔ)上，研究了組織工程材料降解產(chǎn)物的血管化功能，結(jié)合對(duì)材料降解產(chǎn)物的表征和降解規(guī)律的研究，探討了降解時(shí)間及降解產(chǎn)物組分與血管化功能之間的關(guān)系。同時(shí)還

3、研究了改性對(duì)材料/細(xì)胞界面上內(nèi)皮細(xì)胞行為的影響。 1．建立了組織工程材料降解產(chǎn)物血管化功能表征體系。 依據(jù)血管形成過(guò)程及其分子調(diào)節(jié)機(jī)制，選擇內(nèi)皮細(xì)胞形成血管的三大步驟(包括增殖、遷移和血管樣結(jié)構(gòu)TLS的形成)為細(xì)胞水平指標(biāo)，調(diào)節(jié)血管形成的VEGF、MMP-2的基因表達(dá)和F-actin重組作為分子水平指標(biāo)，建立了組織工程材料降解產(chǎn)物血管化功能細(xì)胞水平和分子水平的的表征體系。新建了細(xì)胞遷移定量檢測(cè)方法CMQM;新建了TLS的

4、定量檢測(cè)方法TLSQM;選擇MTT比色法檢測(cè)細(xì)胞增殖，實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR技術(shù)檢測(cè)VEGF和MMP-2 mRNA的表達(dá)；BODIPYFL標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽標(biāo)記F-actin，在熒光顯微鏡下觀察其組裝情況。 2．研究了三類組織工程材料降解產(chǎn)物的血管化功能。 分別以殼聚糖、聚乳酸和摻鍶聚磷酸鈣為例，以生理鹽水為降解介質(zhì)和對(duì)照，采用上述表征體系對(duì)天然高分子、合成高分子及生物陶瓷三大類組織工程材料降解產(chǎn)物的血管化功能進(jìn)行了研究。

5、結(jié)果表明，三類材料在生理鹽水中均可降解，降解產(chǎn)物隨時(shí)間累積，改變細(xì)胞生長(zhǎng)的微環(huán)境，并對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞形成血管的重要步驟和調(diào)節(jié)血管形成的功能蛋白表達(dá)以及細(xì)胞骨架重構(gòu)都有顯著影響：可抑制也可促進(jìn)血管化，取決于材料的種類和降解時(shí)間。且細(xì)胞水平和分子水平結(jié)果基本一致(摻鍶聚磷酸鈣的研究還表明體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和體外表征結(jié)果一致)。但降解時(shí)間的影響以及降解產(chǎn)物中單體所起的作用都各有不同。分述如下： (1)天然高分子殼聚糖(CS)降解產(chǎn)物的血管化功能降

6、解時(shí)間的影響：在120天的降解時(shí)間內(nèi)，細(xì)胞反應(yīng)受到抑制不是在降解后期，而是在降解中期(20天～60天)。提示，天然高分子材料CS降解時(shí)間的延長(zhǎng)和降解產(chǎn)物的累積不是影響內(nèi)皮細(xì)胞行為的決定因素。不同時(shí)期產(chǎn)生的降解產(chǎn)物可能具有不同的分子結(jié)構(gòu)，從而具有不同的生物活性。 氨基葡萄糖(GS)單體的作用：在120天的降解時(shí)間內(nèi)，CS降解液中GS濃度介于0.05～0.37mmol/L范圍內(nèi)。該濃度下，單純的GS對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移無(wú)顯著影響，對(duì)

7、TLS的作用效果也不同于降解液。提示，CS的降解產(chǎn)物中，影響內(nèi)皮細(xì)胞行為的主要因素不是GS單體及其量的累積，而可能是GS齊聚物或與GS單體的共同作用。 (2)合成高分子聚乳酸(PLA)降解產(chǎn)物的血管化功能降解時(shí)間的影響：降解初期(前7天)，對(duì)細(xì)胞增殖、遷移和TLS的形成均無(wú)不良影響，或有一定促進(jìn)。但隨著降解時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞行為受到抑制：降解30天后顯著抑制細(xì)胞遷移和TLS形成，降解90天顯著抑制細(xì)胞增殖。提示，對(duì)合成材料PLA，

8、適量的降解產(chǎn)物有促血管化功能，而過(guò)量累積則會(huì)嚴(yán)重敖壞細(xì)胞生態(tài)環(huán)境，抑制其生長(zhǎng)。乳酸(LA)單體的作用：120天的降解時(shí)間內(nèi)，PLA降解液中LA單體濃度介于(16.13～431.32]mmol/L 之間，堿水解后LA總濃度介于(63.91～799.91)mmol/L之間。該濃度下單純的LA已顯著抑制細(xì)胞行為，但PLA降解液中LA濃度達(dá)到190mmol/L時(shí)才對(duì)細(xì)胞增殖有顯著抑制。提示，乳酸齊聚物的存在可降低高濃度單分子乳酸對(duì)細(xì)胞的毒性作用

9、。 (3)生物陶瓷摻鍶聚磷酸鈣(SCPP)的血管化功能降解時(shí)間的影響：與生理鹽水和聚磷酸鈣(CPP)比較，SCPP90天的降解產(chǎn)物對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞行為幾乎都有促進(jìn)作用。 鍶元素的作用：?jiǎn)渭兊逆J元素對(duì)細(xì)胞遷移無(wú)明顯影響，但濃度在10nmol/L～1mmol/L范圍內(nèi)可不同程度地提高細(xì)胞增殖和形成TLS能力。SCPP90天降解產(chǎn)物中鍶元素濃度介于3.92μmol/L～20.65gmol/L之間，對(duì)血管化有明顯的促進(jìn)作用。

10、3.組織工程材料改性對(duì)材料/細(xì)胞界面上內(nèi)皮細(xì)胞行為的影響 對(duì)本論文重點(diǎn)研究的三種生物材料(CS、PLA以及CPP)分別進(jìn)行改性，研究改性前后材料的細(xì)胞毒性和材料/細(xì)胞界面反應(yīng)對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞行為的影響，結(jié)合改性前后材料性質(zhì)變化探討了改性對(duì)細(xì)胞行為影響的機(jī)理。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，改性對(duì)三種材料的細(xì)胞毒性均無(wú)不良影響，卻顯著改變了細(xì)胞在材料表面的粘附、鋪展以及形成TLS等行為。分述如下： (1)海藻酸鈉(ALG)改性對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞在CS表面行為

11、的影響： 改性對(duì)CS表面性質(zhì)的影響：AFM和水接觸角實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，海藻酸鈉改性能顯著降低CS的表面粗糙度，增加表面親水性； 改性對(duì)細(xì)胞行為的影響：細(xì)胞在CS表面形成TLS結(jié)構(gòu)，與膠原凝膠表面的TLS類似；但改性后的表面具有抗內(nèi)皮細(xì)胞粘附的性能。材料表面親水性的增加和粗糙度的下降可能導(dǎo)致細(xì)胞粘附下降的原因。 (2)磷脂膽堿改性對(duì)PLA表面內(nèi)皮細(xì)胞行為的影響： 改性對(duì)PLA表面性質(zhì)的影響：水接觸角和攝水率結(jié)果

12、表明，磷脂膽堿改性能提高聚乳酸的親水性，且隨著磷脂含量的增加，親水性增強(qiáng)；XPS分析表明，改性后的材料在水環(huán)境發(fā)生表面重構(gòu)，磷脂膽堿基團(tuán)從材料的本體向表面發(fā)生翻轉(zhuǎn)。改性對(duì)細(xì)胞行為的影響：與改性前相比，PC/LLA比例為1/46和1/30的材料表面，細(xì)胞的粘附和鋪展相對(duì)滯后，但繼續(xù)培養(yǎng)，細(xì)胞能在材料上完全粘附和鋪展，并且增殖。細(xì)胞初期粘附鋪展滯后可能是材料親水性增強(qiáng)造成的。而具有生物活性的磷脂官能團(tuán)向材料表面翻轉(zhuǎn)使材料表面發(fā)生重構(gòu)，可能是

13、使細(xì)胞最終實(shí)現(xiàn)粘附并增殖的原因。 (3)摻鍶改性對(duì)CPP表面內(nèi)皮細(xì)胞行為的影響： 改性對(duì)CPP表面性質(zhì)的影響：摻鍶能顯著影響CPP的微觀結(jié)構(gòu)。摻鍶后材料晶粒尺寸增大，晶粒間連接緊密，形成更平滑的表面；摻鍶能顯著減少CPP經(jīng)培養(yǎng)液浸泡后表面形成的凝膠狀物質(zhì)。 改性對(duì)細(xì)胞行為的影響：摻鍶改性能顯著促進(jìn)ECV304細(xì)胞在CPP表面的粘附和鋪展，其原因可能是摻鍶減少CPP凝膠并降低其表面粗糙度。 本論文首次建立了

14、組織工程材料降解產(chǎn)物血管化功能表征體系，為組織工程材料功能性的表征和評(píng)價(jià)提供新的思路和方法參考。對(duì)三類生物材料的表征發(fā)現(xiàn)，材料降解產(chǎn)物可改變細(xì)胞的微生態(tài)環(huán)境，進(jìn)而顯著改變內(nèi)皮細(xì)胞形成血管的關(guān)鍵步驟以及調(diào)節(jié)血管形成的生長(zhǎng)因子和蛋白酶的基因表達(dá)。該結(jié)果提示要解決組織工程中的血管化問(wèn)題，必須重視材料降解產(chǎn)物對(duì)血管化的影響。對(duì)組織工程材料不僅要評(píng)價(jià)其安全性，還應(yīng)深入研究其血管化功能。本論文的研究也為解決組織工程血管化問(wèn)題探索了從非生長(zhǎng)因子角度促