組胺及其H2受體在心肌肥厚中作用及機(jī)制的研究.pdf

1、研究意義:
　　壓力后負(fù)荷導(dǎo)致的心肌肥厚是心力衰竭病理過程中至關(guān)重要的環(huán)節(jié)。許多的機(jī)制試著來闡明這種壓力負(fù)荷導(dǎo)致心肌結(jié)構(gòu)的改變,其中一種就是體液因子如血管緊張素II、腎上素等的釋放促進(jìn)心肌肥厚的發(fā)生。而這些體液因子發(fā)揮促肥厚作用主要是通過Gq和Gs蛋白偶聯(lián)受體介導(dǎo)的。組胺及其受體在心血管中廣泛分布,但是有關(guān)心臟局部組胺的來源,以及組胺與其它傳統(tǒng)導(dǎo)致心肌肥厚的因素的關(guān)系一直未見報(bào)道。
　　本課題采用主動(dòng)脈縮窄術(shù)(TAC術(shù))致心

2、肌肥厚模型,引進(jìn)組氨酸脫羧酶基因敲除的小鼠,從整體動(dòng)物到單個(gè)細(xì)胞水平,證實(shí)組胺是否參與心肌肥厚的病理過程,并探討介導(dǎo)組胺作用的受體以及機(jī)制。為進(jìn)一步的深入研究心肌肥厚的致病機(jī)制,為臨床治療心肌肥厚提供新的藥物靶點(diǎn)。
　　目的:
　　1)明確組胺及其組胺H2受體參與心肌肥厚的作用。
　　2)探討激動(dòng)組胺H2受體促心肌肥厚的作用的分子學(xué)機(jī)制。
　　方法:
　　1)主動(dòng)脈弓縮窄術(shù)與腹腔注射藥物的方法建立心肌肥厚的

3、動(dòng)物模型。
　　2)原代心肌細(xì)胞培養(yǎng)的方法建立體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?br>　　3)藥理學(xué)的方法給予組胺H2受體的拮抗劑法莫替丁與阻滯dimaprit。
　　4)ELISA的方法檢測心肌組織與血漿中組胺的含量。
　　5)細(xì)胞免疫熒光的方法檢測心肌細(xì)胞中特異性蛋白a-actinin。
　　6)westernblot的方法檢測目標(biāo)蛋白的表達(dá)變化。
　　7)應(yīng)用膜片鉗技術(shù)檢測ⅠCa-L開放的情況。
　　8)Re

4、al-TimePCR檢測心肌肥厚相關(guān)標(biāo)志物的mRNA的表達(dá)情況。
　　9)HE染色檢測心肌組織形態(tài)學(xué)改變。
　　10)采用小動(dòng)物超觀察小鼠心臟功能指標(biāo)。
　　結(jié)果:
　　1)觀察其致心肌肥厚模型建立是否成功。TAC術(shù)后4周進(jìn)行小動(dòng)物M型超聲觀察,與sham組相比,TAC術(shù)組的小鼠左心室射血分?jǐn)?shù)(EF％)和短軸縮短率(Fs%)均明顯的降低(P<0.01),心體比、心肌細(xì)胞橫截面積以及ANP、BNP均顯著升高(P<0

5、.01),說明心肌肥厚模型建立成功。TAC術(shù)后2W、4W用小鼠組胺 ELISA試劑盒檢測心肌組織與血漿中組胺的含量,發(fā)現(xiàn)組胺含量增加且存在一定的時(shí)間-效應(yīng)關(guān)系,在4W時(shí),與sham組相比,血漿與心肌組織中組胺的含量分別增加了46.7%、54.2%,這些數(shù)據(jù)提示了組胺可能參與了壓力后負(fù)荷誘導(dǎo)的心肌肥厚的病理生理過程,為了證實(shí)這一點(diǎn),我們引進(jìn)組氨酸脫羧酶基因敲出的小鼠,在TAC術(shù)后4W,與野生型小鼠相比,發(fā)現(xiàn)心肌肥厚指標(biāo):心體比、心肌細(xì)胞橫

6、截面積和ANP、BNP的表達(dá)量均顯著降低(P<0.01),而心功能指標(biāo)射血分?jǐn)?shù)與短軸縮短率顯著上調(diào)(P<0.01)。這些結(jié)果證實(shí)組胺參與壓力后負(fù)荷導(dǎo)致的心肌肥厚的病理生理過程。
　　2) western-blot檢測TAC術(shù)4W后組胺H1、H2受體的表達(dá)量的變化,與sham組相比,組胺H2受體的表達(dá)量明顯上調(diào)(P<0.01),而組胺H1受體的表達(dá)量變化沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而上述結(jié)果提示組胺可能是通過激活心肌組織上的組胺H2受體來參與心

7、肌肥厚的病理過程。為了證實(shí)上面的結(jié)論,我們采用藥理學(xué)研究方法,觀察組胺H2受體的激動(dòng)劑與拮抗劑與對心肌肥厚病理生理的影響。通過應(yīng)用組胺H2受體特異性激動(dòng)劑dimaprit作用于整體動(dòng)物的心肌組織與離體心肌細(xì)胞,直接觀察組胺H2受體是否參與心肌肥厚的病理過程。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn):給予C57小鼠dimaprit干預(yù),導(dǎo)致小鼠心體比、心肌細(xì)胞橫截面積與心肌肥厚相關(guān)標(biāo)志性基因表達(dá)量明顯增高(P<0.01),同時(shí)通過小鼠M型超聲檢測發(fā)現(xiàn)心功能指標(biāo)左室射血

8、分?jǐn)?shù)與左室短軸縮短率均明顯降低(P<0.01);給予C57小鼠乳鼠提取的原代心肌細(xì)胞dimaprit進(jìn)行干預(yù),導(dǎo)致心肌細(xì)胞橫截面積、心肌肥厚相關(guān)標(biāo)志性基因表達(dá)量顯著增加(P<0.01)。且這與dimaprit之間存在一定的劑量-效應(yīng)關(guān)系,進(jìn)一步提示了激動(dòng)組胺 H2受體參與心肌肥厚的病理過程。另一方面,建立 TAC心肌肥厚模型,給予組胺 H2受體拮抗劑 famotidine,檢測發(fā)現(xiàn) famotidine可以導(dǎo)致TAC術(shù)后4W小鼠心體比、

9、心肌細(xì)胞橫截面積、ANP的mRNA的表達(dá)量均顯著降低(P<0.01),并且改善心功能指標(biāo)左心室射血分?jǐn)?shù)與左心室端州縮短率等(P<0.01),這些證據(jù)在提示famotidine有延緩TAC術(shù)導(dǎo)致心肌肥厚的病理進(jìn)程效應(yīng),并且famotidine劑量與心肌肥厚的程度呈負(fù)相關(guān),進(jìn)一步提示組胺H2受體拮抗劑可以延緩心肌肥厚的病理生理過程。以上兩個(gè)實(shí)驗(yàn)證實(shí)了組胺可能參與心肌肥厚的病理生理過程。
　　3)將原代心肌細(xì)胞分成 control組、i

10、soprenaline組、histamine組、dimaprit組、famotidine組以及dimaprit與famotidine共同用藥組,給予各種處理48h,dimaprit與histamine可以顯著提高磷酸化的PKA與CaMKⅡ的表達(dá)量(P<0.01),且給予famotidine又可以阻滯dimaprit導(dǎo)致的磷酸化的PKA與CaMKⅡ的上調(diào)(P<0.01)。而對于Epac1、Epac2沒有任何統(tǒng)計(jì)學(xué)上的改變。這些結(jié)果提示激動(dòng)

11、組胺H2受體后,通過第二信使PKA的活化,鈣離子的積累最終介導(dǎo)CaMKⅡ誘發(fā)心肌肥厚的發(fā)生。細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度升高是誘發(fā)心肌肥厚、心肌缺血再灌注損傷等心血管疾病的病理生理的中心環(huán)節(jié)。肌質(zhì)網(wǎng)ryanodine內(nèi)鈣釋放是導(dǎo)致心肌細(xì)胞內(nèi)鈣濃度升高的主要來源,而L型鈣通道開放是調(diào)控肌質(zhì)網(wǎng)ryanodine受體的主要因素,L型鈣通道的密度越大,其誘發(fā)的心肌肥厚的程度會(huì)越大。我們研究發(fā)現(xiàn),組胺H2受體激動(dòng)劑dimaprit可以促進(jìn)L型鈣通道的開放,

12、使L型鈣通道的數(shù)目增加,進(jìn)而引發(fā)細(xì)胞內(nèi)的鈣超載,而famotidine可以抑制dimaprit誘發(fā)的L型鈣通道的開放,緩解心肌細(xì)胞內(nèi)鈣超載引發(fā)的心肌肥厚。這說明激動(dòng)組胺H2受體可以誘導(dǎo) L型鈣通道的開放。綜上所示,組胺H2受體激活后,可能是通過PKA-Ca2+-CaMKⅡ信號(hào)通路軸來介導(dǎo)心肌肥厚的發(fā)生。
　　結(jié)論:
　　1)組胺及其H2受體參與了心肌肥厚的病理過程。
　　2)組胺H2受體激動(dòng)后,通過經(jīng)典的Gs-pka-