核受體FXR在心肌重構(gòu)中的關(guān)鍵作用及其機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　我們課題組近年研究發(fā)現(xiàn)：核受體FXR(farnesoid X receptor,FXR)在心肌細(xì)胞中有表達(dá)，且激活FXR能促進(jìn)心肌細(xì)胞凋亡，參與心肌缺血再灌注損傷病理過(guò)程，提示內(nèi)源性FXR可能是心肌細(xì)胞中新的具有功能活性的核受體。然而，F(xiàn)XR在心肌重構(gòu)中的作用目前尚不清楚。因此，本研究的目的旨在闡明核受體FXR在壓力負(fù)荷誘導(dǎo)的心肌重構(gòu)中的關(guān)鍵作用及其分子機(jī)制。
　　內(nèi)容：
　　首先，通過(guò)基因?qū)W干預(yù)方法，采用

2、FXR基因敲除小鼠，建立主動(dòng)脈縮窄（transverse aortic constriction，TAC）模型，觀察其對(duì)心肌重構(gòu)病理進(jìn)程的影響；第二，通過(guò)分子生物學(xué)方法研究FXR信號(hào)通路參與調(diào)控壓力負(fù)荷誘導(dǎo)的心肌重構(gòu)病理進(jìn)展的分子機(jī)制；最后，通過(guò)逆轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證FXR調(diào)控心肌重構(gòu)的關(guān)鍵靶點(diǎn)為轉(zhuǎn)錄因子環(huán)磷腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白（cAMP-response element binding protein，CREB）。
　　方法：
　　

3、以成年雄性C57BL/6小鼠以及FXR基因敲除（FXR KO）小鼠為研究對(duì)象，采用主動(dòng)脈縮窄（TAC）的方法構(gòu)建小鼠心肌重構(gòu)模型。整個(gè)研究分為：
　　1）明確FXR KO小鼠TAC術(shù)后心肌重構(gòu)的表型；
　　2）闡明FXR參與調(diào)控心肌重構(gòu)的分子機(jī)制；
　　3）逆轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證FXR調(diào)控心肌重構(gòu)的關(guān)鍵靶點(diǎn)。
　　所有小鼠TAC術(shù)后于2周、4周、8周時(shí)隨訪。我們采用熒光定量PCR和Western Blot方法檢測(cè)FXR的表

4、達(dá)變化；用心臟大體標(biāo)本和病理切片染色明確FXR基因敲除對(duì)心肌重構(gòu)病理進(jìn)程的影響；用心臟超聲和有創(chuàng)血流動(dòng)力學(xué)檢查評(píng)估心功能；用TUNEL染色和測(cè)定Caspase活性方法檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡，通過(guò)測(cè)定Caspase-8、-9、-12活性、免疫組化、免疫熒光、Western Blot、透射電鏡、熒光定量PCR等方法研究FXR對(duì)凋亡、自噬、氧化應(yīng)激的調(diào)控作用；用Western Blot和凝膠遷移實(shí)驗(yàn)（electrophoretic mobility

5、 shift assay，EMSA）闡明FXR參與調(diào)控心肌重構(gòu)的信號(hào)通路；用9型重組腺相關(guān)病毒（recombined adeno-associated virus serotype9，r AAV9）轉(zhuǎn)染心肌的方法進(jìn)行心肌特異性基因干擾/過(guò)表達(dá)，證明核受體 FXR在心肌重構(gòu)中的調(diào)控作用并驗(yàn)證FXR調(diào)控心肌重構(gòu)時(shí)的關(guān)鍵靶點(diǎn)。
　　結(jié)果：
　　心肌組織中可以檢測(cè)到FXR的基礎(chǔ)表達(dá)，其表達(dá)量在TAC術(shù)后8周顯著上調(diào)。采用基因?qū)W干預(yù)方

6、法敲除FXR基因明顯減輕心肌肥厚、抑制病理性纖維化改變、延緩壓力負(fù)荷誘導(dǎo)的心功能惡化。進(jìn)一步機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)FXR KO可以明顯減輕心肌重構(gòu)過(guò)程中伴隨的氧化應(yīng)激反應(yīng)、抑制線粒體功能紊亂介導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡、改善自噬功能失調(diào)、逆轉(zhuǎn)代謝相關(guān)基因表達(dá)的下調(diào)。通過(guò)在體r AAV9介導(dǎo)的心肌特異性CREB基因干擾，我們發(fā)現(xiàn)FXR基因敲除對(duì)心肌重構(gòu)進(jìn)展的抑制作用消失。
　　結(jié)論：
　　FXR是一種新發(fā)現(xiàn)的參與心肌重構(gòu)病理進(jìn)展過(guò)程的核受體，F(xiàn)X