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文檔簡介
1、目的:
我們課題組近年研究發(fā)現(xiàn):核受體FXR(farnesoid X receptor,FXR)在心肌細胞中有表達,且激活FXR能促進心肌細胞凋亡,參與心肌缺血再灌注損傷病理過程,提示內(nèi)源性FXR可能是心肌細胞中新的具有功能活性的核受體。然而,F(xiàn)XR在心肌重構(gòu)中的作用目前尚不清楚。因此,本研究的目的旨在闡明核受體FXR在壓力負荷誘導的心肌重構(gòu)中的關(guān)鍵作用及其分子機制。
內(nèi)容:
首先,通過基因?qū)W干預方法,采用
2、FXR基因敲除小鼠,建立主動脈縮窄(transverse aortic constriction,TAC)模型,觀察其對心肌重構(gòu)病理進程的影響;第二,通過分子生物學方法研究FXR信號通路參與調(diào)控壓力負荷誘導的心肌重構(gòu)病理進展的分子機制;最后,通過逆轉(zhuǎn)實驗驗證FXR調(diào)控心肌重構(gòu)的關(guān)鍵靶點為轉(zhuǎn)錄因子環(huán)磷腺苷效應元件結(jié)合蛋白(cAMP-response element binding protein,CREB)。
方法:
3、以成年雄性C57BL/6小鼠以及FXR基因敲除(FXR KO)小鼠為研究對象,采用主動脈縮窄(TAC)的方法構(gòu)建小鼠心肌重構(gòu)模型。整個研究分為:
1)明確FXR KO小鼠TAC術(shù)后心肌重構(gòu)的表型;
2)闡明FXR參與調(diào)控心肌重構(gòu)的分子機制;
3)逆轉(zhuǎn)實驗驗證FXR調(diào)控心肌重構(gòu)的關(guān)鍵靶點。
所有小鼠TAC術(shù)后于2周、4周、8周時隨訪。我們采用熒光定量PCR和Western Blot方法檢測FXR的表
4、達變化;用心臟大體標本和病理切片染色明確FXR基因敲除對心肌重構(gòu)病理進程的影響;用心臟超聲和有創(chuàng)血流動力學檢查評估心功能;用TUNEL染色和測定Caspase活性方法檢測心肌細胞凋亡,通過測定Caspase-8、-9、-12活性、免疫組化、免疫熒光、Western Blot、透射電鏡、熒光定量PCR等方法研究FXR對凋亡、自噬、氧化應激的調(diào)控作用;用Western Blot和凝膠遷移實驗(electrophoretic mobility
5、 shift assay,EMSA)闡明FXR參與調(diào)控心肌重構(gòu)的信號通路;用9型重組腺相關(guān)病毒(recombined adeno-associated virus serotype9,r AAV9)轉(zhuǎn)染心肌的方法進行心肌特異性基因干擾/過表達,證明核受體 FXR在心肌重構(gòu)中的調(diào)控作用并驗證FXR調(diào)控心肌重構(gòu)時的關(guān)鍵靶點。
結(jié)果:
心肌組織中可以檢測到FXR的基礎(chǔ)表達,其表達量在TAC術(shù)后8周顯著上調(diào)。采用基因?qū)W干預方
6、法敲除FXR基因明顯減輕心肌肥厚、抑制病理性纖維化改變、延緩壓力負荷誘導的心功能惡化。進一步機制研究發(fā)現(xiàn)FXR KO可以明顯減輕心肌重構(gòu)過程中伴隨的氧化應激反應、抑制線粒體功能紊亂介導的心肌細胞凋亡、改善自噬功能失調(diào)、逆轉(zhuǎn)代謝相關(guān)基因表達的下調(diào)。通過在體r AAV9介導的心肌特異性CREB基因干擾,我們發(fā)現(xiàn)FXR基因敲除對心肌重構(gòu)進展的抑制作用消失。
結(jié)論:
FXR是一種新發(fā)現(xiàn)的參與心肌重構(gòu)病理進展過程的核受體,F(xiàn)X
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