ALI時肺內TREMs家族表達譜的變化、TREM-2的保護作用及血管活性腸肽的調控.pdf

1、本課題觀察到TREM-2在AM和成纖維細胞表達較為豐富。因此，深入研究TREM-2對AM炎癥啟動與放大和對成纖維細胞凋亡的影響，可明確TREM-2在ALI早期的作用及地位，有利于闡明ALI的發(fā)病機制，篩選新的治療靶點。
　　 血管活性腸肽(vasoactive intestinal peptide，VIP)是肺內含量最為豐富的神經肽之一，具有增強支氣管上皮細胞的趨化遷移、擴張血管、舒張氣道平滑肌、清除氧自由基及抗細胞凋亡等多種生

2、物學作用。肺內VIP是否可通過調控TREM-2的表達，使ALI時肺內炎癥反應和損傷修復處于對機體有利而又不會造成組織器官損傷的范圍內值得探討。
　　 目的:分析ALI時肺內TREMs家族表達譜的變化，探討TREM-2在肺內的功能以及VIP對TREM-2的表達調控。
　　 方法:(1)腹腔注射LPS復制小鼠ALI動物模型，采用Buxco小動物呼吸功能檢測系統和形態(tài)學指標驗證模型的建立;RT-PCR和Western Blot

3、法檢測肺組織中TREM-1、TREM-2、TREM-3、TLT-1、TLT-2及TLT-4的表達;RT-PCR和流式細胞術檢測AM、成纖維細胞、支氣管上皮細胞及肺泡Ⅱ型上皮細胞TREM-1、TREM-2、TREM-3、TLT-1、TLT-2及TLT-4的表達。(2)構建pEGFP-N1/TREM-2重組質粒并轉染AM，采用熒光顯微鏡、RT-PCR及流式細胞術檢測TREM-2重組質粒的轉染和表達;RT-PCR和ELISA檢測TREM-2對

4、LPS應激的AM中TNF-a和IL-10表達的影響;RT-PCR檢測TREM-2對LPS應激的AM中NF-κB mRNA表達的影響，免疫熒光檢測TREM-2對LPS應激的AM中NF-κB核轉位的影響。(3) pEGFP-N1質粒和pEGFP-N1/TREM-2重組質粒轉染至成纖維細胞，采用熒光顯微鏡和Real-time PCR檢測pEGFP-N1/TREM-2重組質粒的轉染和表達;流式細胞術和PI染色檢測TREM-2對成纖維細胞凋亡的影

5、響;RT-PCR和凋亡蛋白活性檢測試劑盒檢測成纖維細胞caspase3、caspase8及caspase9的表達和活性。(4)構建pGC-FU-VIP重組慢病毒并感染昆明小鼠;RT-PCR和Western Blot檢測VIP對ALI小鼠肺組織中TREM-2表達的影響，并采用Real-time PCR和流式細胞術檢測VIP對LPS應激的巨噬細胞TREM-2表達的調控及其機制。
　　 結果:
　　 1.ALI時小鼠肺內TRE

6、Ms家族的表達譜分析
　　 (1) Buxco小動物肺功能檢測顯示:ALI小鼠的呼吸頻率、肺順應性、潮氣量均低于正常小鼠;而ALI小鼠氣道阻力明顯大于正常小鼠的氣道阻力(P＜0.05)。進一步采用HE染色觀察到ALI小鼠的肺泡隔增厚，大量炎性細胞浸潤，滲出明顯增加。
　　 (2) TREMs家族的主要成員TREM-1、TREM-2、TREM-3、TLT-1、TLT-2及TLT-4在正常小鼠肺組織中均有表達，其中以TREM

7、-1的表達最少，TREM-2的表達最多。與正常組相比，ALI組小鼠肺組織中TREM-1、TREM-3、TLT-1、TLT-2和TLT-4 mRNA的表達均明顯升高，而TREM-2 mRNA的表達降低(P＜0.05)。Westem Blot檢測TREM-1和TREM-2表達的結果與RT-PCR結果一致。
　　 (3) RT-PCR檢測結果顯示:靜息狀態(tài)的成纖維細胞、肺泡Ⅱ型上皮細胞及支氣管上皮細胞均表達TREM-2 mRNA，但未

8、見明顯的TREM-1、TREM-3、TLT-1、TLT-2及TLT-4 mRNA的表達;靜息狀態(tài)的AM表達TREM-1、TREM-2、TREM-3、TLT-1、TLT-2及TLT-4mRNA，而LPS應激的AM中TREM-1、TREM-3、TLT-1、TLT-2及TLT-4 mRNA表達均升高，但TREM-2 mRNA表達降低(P＜0.05)。流式細胞術檢測結果與上述RT-PCR結果一致。
　　 2.pEGFP-N1/TREM-

9、2重組質粒的構建及TREM-2對AM炎癥啟動和放大效應的影響
　　 (1)成功構建pEGFP-N1/TREM-2重組質粒，并轉染至AM。熒光顯微鏡檢測顯示轉染效率約為40％。RT-PCR和流式細胞術檢測檢測顯示pEGFP-N1/TREM-2重組質粒轉染組AM中TREM-2表達明顯高于pEGFP-N1質粒轉染組(P＜0.01)。
　　 (2) RT-PCR檢測顯示LPS應激的AM中TNF-a mRNA表達明顯增加。與LPS

10、+pEGFP-N1質粒組相比，LPS+pEGFP-N1/TREM-2重組質粒轉染組的AM中TNF-a mRNA表達明顯降低。ELISA檢測結果顯示LPS+pEGFP-N1/TREM-2重組質粒轉染組AM的上清液中TNF-a蛋白含量（260.64±47.58）pg/mL明顯低于LPS+pEGFP-N1質粒轉染組（352.16±43.82）pg/mL(P＜0.05)。
　　 (3) RT-PCR檢測表明:與LPS+pEGFP-N1質

11、粒轉染組相比，LPS+pEGFP-N1/TREM-2重組質粒轉染組AM中IL-10mRNA表達明顯升高。ELISA檢測結果顯示LPS+pEGFP-N1/TREM-2重組質粒轉染組AM的上清液中IL-10蛋白含量（242.96±63.23）pg/mL明顯高于LPS+pEGFP-N1質粒轉染組（184.38±34.33）pg/mL(P＜0.05)。
　　 (4)LPS組的AM中NF-κB mRNA的表達明顯高于正常對照組;LPS+p

12、EGFP-N1質粒轉染組的AM中NF-κB mRNA的表達明顯高于pEGFP-N1質粒轉染組;而LPS+pEGFP-N1/TREM-2重組質粒轉染組AM中NF-κB mRNA的表達明顯低于LPS+pEGFP-N1質粒轉染組(P＜0.05)。與正常對照組相比，LPS應激的AM中NF-κB的核轉位明顯增多;LPS+pEGFP-N1/TREM-2重組質粒轉染組AM中NF-κB核轉位明顯少于LPS+pEGFP-N1質粒轉染組。
　　 3

13、.TREM-2對小鼠成纖維細胞凋亡的影響
　　 (1)pEGFP-N1和pEGFP-N1/TREM-2重組質粒轉染至小鼠成纖維細胞后，Real-time PCR檢測顯示pEGFP-N1/TREM-2重組質粒轉染組的小鼠成纖維細胞TREM-2 mRNA表達明顯高于pEGFP-N1質粒轉染組(P＜0.01)。
　　 (2)流式細胞術檢測結果顯示:pEGFP-N1質粒轉染組小鼠成纖維細胞G1期百分比（70.88％±1.17％）

14、高于pEGFP-N1/TREM-2重組質粒轉染組（67.13％±1.35％），且pEGFP-N1質粒轉染組小鼠成纖維細胞的凋亡率（0.96％±0.16％）大于pEGFP-N1/TREM-2重組質粒轉染組（0.66％±0.05％）。PI染色結果表明:LPS處理可顯著增加成纖維細胞凋亡細胞的百分比，而LPS+pEGFP-N1/TREM-2重組質粒轉染組（23.67％±8.08％）中凋亡細胞的百分比明顯低于LPS+pEGFP-N1質粒轉染組（

15、59.33％±17.34％）(P＜0.01)。
　　 (3)與正常對照組相比，LPS應激的小鼠成纖維細胞caspase3、caspase8和caspase9 mRNA表達升高，而LPS+pEGFP-N1/TREM-2重組質粒轉染組小鼠成纖維細胞caspase3、caspase8和caspase9mRNA表達明顯低于LPS+pEGFP-N1質粒轉染組(P＜0.05)。LPS應激的小鼠成纖維細胞caspase3、caspase8及c

16、aspase9活性均顯著強于正常對照組，而LPS+pEGFP-N1/TREM-2重組質粒轉染組的小鼠成纖維細胞caspase3、caspase8及caspase9活性均弱于LPS+pEGFP-N1質粒轉染組(P＜0.05)。
　　 4.VIP對ALI時TREM-2的表達調控
　　 (1) pGC-FU-VIP重組慢病毒構建成功后，熒光顯微鏡觀察到肺內綠色熒光強度與pGC-FU-VIP重組慢病毒滴度呈正相關。RT-PCR檢

17、測顯示ALI小鼠肺組織VIP mRNA表達升高，而感染pGC-FU-VIP重組慢病毒的ALI小鼠肺組織中VIP mRNA表達明顯高于ALI組及感染pGC-FU慢病毒的ALI小鼠(P＜0.01)。
　　 (2)與正常對照組相比，ALI組小鼠肺組織TREM-2 mRNA表達降低，而VIP可增加ALI組小鼠肺組織TREM-2 mRNA表達(P＜0.01)。不同濃度(10-10、10-9、10-8、10-7和10-6 mol/L)的VI

18、P對靜息狀態(tài)的巨噬細胞TREM-2表達無明顯影響(P＞0.05);VIP(10-8mol/L)處理后不同時間點(0、2、4、6、12和24 h)巨噬細胞TREM-2mRNA表達無明顯變化(P＞0.05);VIP可呈劑量和時間依賴性上調LPS應激的巨噬細胞TREM-2 mRNA的表達(P＜0.05)。流式細胞術檢測顯示VIP對靜息狀態(tài)的巨噬細胞TREM-2表達無明顯影響，但可增加LPS應激的巨噬細胞TREM-2的表達(P＜0.01)。

19、r>　　 (3) RT-PCR檢測表明VIP受體拮抗劑可減少VIP對LPS應激的巨噬細胞TREM-2 mRNA的表達(P＜0.05)。流式細胞術檢測顯示:與LPS+VIP組相比，LPS+VIP+VIP受體拮抗劑組巨噬細胞TREM-2蛋白表達降低(P＜0.05);與LPS+VIP組相比，信號通路阻斷劑H-89和PD98059可降低巨噬細胞TREM-2的表達(P＜0.01)。
　　 (4)通過JASPAR和IFTI數據庫對調控小鼠

20、肺內TREM-2表達的轉錄因子進行生物信息學分析，結果顯示AP1和NF-κB可能是調控TREM-2表達的核心轉錄因子;Real-time PCR檢測表明VIP可增加LPS應激的巨噬細胞AP1 mRNA的表達(P＜0.05)。流式細胞術檢測結果顯示:采用NF-κB抑制劑可增加LPS應激的巨噬細胞TREM-2的平均熒光強度(P＜0.05)。
　　 結論:
　　 1.AM表達TREM-1、TREM-3、TLT-1、TLT-2及

21、TLT-4，在ALI時表達均增加;而TREM-2廣泛表達于AM、成纖維細胞、支氣管上皮細胞及肺泡Ⅱ型上皮細胞等多種肺系細胞，在ALI時表達降低。
　　 2.TREM-2可抑制LPS應激的AM中NF-κB的活化，影響AM的激活，進而切斷早期炎癥的啟動和放大。
　　 3.TREM-2可抑制死亡受體和線粒體介導的凋亡通路，減少LPS應激的成纖維細胞的凋亡，維持成纖維細胞數量和功能的動態(tài)平衡，有利于受損肺組織的及時修復。