血管活性腸肽在運(yùn)氣管哮喘小鼠氣道重塑中作用的研究.pdf

1、前言：
　　支氣管哮喘(bronchial asthma)(以下簡稱哮喘)是常見的呼吸系統(tǒng)疾病，已成為嚴(yán)重的社會健康問題，迄今為止，哮喘的發(fā)病機(jī)制尚未完全清楚，但氣道炎癥、氣道高反應(yīng)性及氣道重塑是目前公認(rèn)的哮喘的三大特征，其中氣道重塑可導(dǎo)致不可逆的通氣功能障礙、持續(xù)性氣道反應(yīng)性增高、對支氣管舒張劑敏感性減退等，是出現(xiàn)重癥或難治性哮喘的重要原因。氣道平滑肌細(xì)胞(airway smooth musclecells，ASMCs)作為導(dǎo)致

2、氣道狹窄的主要效應(yīng)細(xì)胞，其異常增殖、凋亡及遷移均能引起氣道壁增厚，它也可以通過釋放多種炎性介質(zhì)加重氣道炎癥，因此ASMCs是氣道重塑研究中的重要成員，有效抑制ASMCs異常增殖、凋亡將會減輕哮喘氣道重塑。
　　血管活性腸肽(vasoactive intestinal peptide，VIP)作為抑制性非腎上腺素能非膽堿能(inhibitory non-adrenergic non-cholinergic，i-NANC)神經(jīng)肽，最初

3、單純被認(rèn)為是一種胃腸激素，調(diào)節(jié)消化系統(tǒng)生理活動，隨著研究的不斷深入，逐漸認(rèn)識到VIP在神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫反應(yīng)中發(fā)揮著更重要的生物學(xué)作用，參與多種生物學(xué)效應(yīng)，如代謝過程、細(xì)胞分化、平滑肌松弛、免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)及免疫穩(wěn)態(tài)的維持等，現(xiàn)研究認(rèn)為VIP與哮喘、慢性阻塞性肺疾病、肺動脈高壓、膿毒癥休克、糖尿病、風(fēng)濕病、學(xué)習(xí)與記憶、多發(fā)性硬化等疾病有關(guān)。
　　ERK1/2信號通路是MAPKs的家族成員，是把細(xì)胞外信號轉(zhuǎn)導(dǎo)到核內(nèi)調(diào)控基因表達(dá)的重要細(xì)

4、胞內(nèi)信號分子，是不同促增殖因子調(diào)控的共同通路，在氣道平滑肌上分布廣泛，主要存在ERK1、ERK2兩種亞型，磷酸化ERK1/2參與ASMCs增殖，對哮喘氣道重塑有調(diào)節(jié)作用。小窩蛋白-1(Caveolae-1，Cav-1)存在于ASMCs表面，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞周期與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，在細(xì)胞凋亡程序中也發(fā)揮著重要作用，具有抗血管新生、負(fù)性調(diào)節(jié)生長因子作用，對血小板源性生長因子(Platelet derivedgrowth factor, PDGF)的負(fù)向

5、調(diào)控可導(dǎo)致平滑肌細(xì)胞由增殖轉(zhuǎn)向凋亡。
　　研究已證實VIP具有支氣管擴(kuò)張、抗炎及抑制平滑肌細(xì)胞(smooth muscle cells，SMCs)增殖作用，目前相關(guān)VIP與氣道炎癥、氣道高反應(yīng)性以及其抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖的研究較多，而VIP對哮喘ASMCs作用及機(jī)制的研究極少。且目前臨床上對哮喘的治療多集中于氣道炎癥控制和喘息癥狀緩解上，但不能有效的控制氣道重塑進(jìn)展。
　　本研究通過卵蛋白致敏及霧化激發(fā)的方法構(gòu)建哮喘小鼠氣

6、道重塑模型，體內(nèi)實驗觀察肺組織VIP及受體VIPR1表達(dá)的變化以及給予VIP治療后對氣道重塑的影響;并進(jìn)行體外ASMCs培養(yǎng)，給予不同濃度VIP以及改變VIP作用時間，分別觀察VIP對哮喘氣道重塑小鼠ASMCs增殖的影響;選擇VIP對ASMCs的最佳作用時間及干預(yù)濃度，探討VIP通過ERK1/2信號通路對ASMC增殖作用的影響，為哮喘的治療提供新的思路。
　　材料和方法：
　　一、實驗材料
　　1、實驗動物
　　

7、6～8周齡SPF級雌性Balb/c小鼠(18～22g)，由中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院實驗動物中心提供。
　　2、主要試劑
　　卵蛋白（美國Sigma公司）
　　氫氧化鋁粉末（上海美興化工股份有限公司）
　　VIP(美國Sigma公司)
　　[D-p-Cl-Phe6,Leu17]-VIP(TOCRIS公司)
　　兔抗小鼠VIP、VIPR1多克隆抗體（北京博奧森公司）
　　DMEM高塘培養(yǎng)基(Gibc

8、o公司)
　?、裥湍z原酶(Invitrogen公司)
　　木瓜蛋白酶（上海生工生物工程有限公司）
　　胰酶（碧云天公司）
　　胎牛血清（Hyclone公司）
　　RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒（碧云天生物技術(shù)研究所）
　　ECL發(fā)光液(Thermo公司)
　　PVDF膜(Millipore公司)
　　IL-13（美國PeProTech公司）
　　Trizol裂解液(Taka

9、ra，寶生物工程有限公司)
　　反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Takara，寶生物工程有限公司)
　　Real-time PCR試劑盒(Takara，寶生物工程有限公司)
　　MTT試劑盒（美國Sigma公司）
　　二、實驗方法
　　1、哮喘氣道重塑小鼠肺組織VIP與受體VIPR1表達(dá)的變化及對氣道重塑的影響
　　哮喘小鼠模型制作:動物適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，第0、7和14天無菌條件下腹腔注射致敏液0.2ml(含OVA10

10、0μg+氫氧化鋁粉末1mg)，第21天開始霧化激發(fā):將小鼠置于自制霧化容器中(20cm×20cm×20cm)，霧化吸入2％ OVA溶液，每次30min，隔天1次，共8周，對照組以PBS進(jìn)行腹腔注射及霧化吸入。
　　實驗分三組:正常對照組、哮喘模型組、VIP治療組，每組8只。其中VIP治療組在每次霧化激發(fā)前半小時給予VIP150μg/kg腹腔注射。
　　應(yīng)用肺組織石蠟切片HE染色觀察各組小鼠肺組織病理變化，應(yīng)用病理圖像分析系統(tǒng)

11、檢測氣道重塑。免疫組化及real-time PCR方法檢測各組肺組織VIP及VIPR1表達(dá)。
　　2、體外實驗研究VIP對IL-13誘導(dǎo)的哮喘小鼠ASMCs增殖的影響
　　哮喘氣道重塑組小鼠造模后，進(jìn)行ASMCs培養(yǎng)，觀察VIP對IL-13誘導(dǎo)的ASMCs增殖的影響。
　?、費(fèi)TT法確定VIP的最佳作用濃度及時間
　　實驗分組:ASMCs
　　ASMCs+VIP(10-5rnM)
　　ASMCs+VI

12、P(10-6mM)
　　ASMCs+VIP(10-7mM)
　?、赩IP對IL-13誘導(dǎo)的ASMCs增殖的影響
　　實驗分組:ASMCs
　　ASMCs+IL-13(10-5g/L)
　　ASMCs+IL-13(10-5g/L)+VIP(10-6mM)
　　ASMCs+IL-13(10-5g/L)+ VIP(10-6mM)+[D-p-Cl-Phe6,Leu17]-VIP(10-6mM)
　　應(yīng)用

13、MTT法檢測各組細(xì)胞增殖及流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期。
　　3、ERK1/2信號通路/Cav-1在VIP對IL-13誘導(dǎo)的ASMCs增殖中的作用
　　實驗分組:ASMCs
　　ASMCs+IL-13(10-5g/L)
　　ASMCs+IL-13(10-5g/L)+VIP(10-6mM)
　　ASMCs+IL-13(10-5g/L)+VIP(10-6mM)+PD98059
　　ASMCs+IL-13(10-

14、5g/L)+VIP(10-6mM)+β-CD
　　ASMCs+IL-13(10-5g/L)+ VIP(10-6mM)+[D-p-Cl-Phe6,Leu17]-VIP(10-6mM)
　　應(yīng)用MTT法檢測各組細(xì)胞增殖及流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期;Western blot方法檢測p-ERK1/2、 ERK1/2、 Cav-1表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1、哮喘氣道重塑小鼠肺組織VIP與受體VIPR1表達(dá)及體內(nèi)實驗觀察VIP對

15、氣道重塑的影響
　　霧化激發(fā)8w小鼠肺組織HE染色可見肺組織有炎細(xì)胞浸潤，纖毛及上皮細(xì)胞脫落，氣道平滑肌層增厚，血管平滑肌層增厚，部分肺泡結(jié)構(gòu)破壞的氣道重塑的病理改變，應(yīng)用病理圖像分析得出哮喘組氣道平滑肌層較正常對照組增厚，而VIP治療組病理改變較哮喘組輕。
　　肺組織免疫組化檢測VIP及VIPR1蛋白表達(dá)及Real-time PCR檢測VIP及VIPR1 mRNA表達(dá)，得出哮喘組較正常對照組表達(dá)均明顯減少。
　　2、

16、體外實驗研究VIP對IL-13誘導(dǎo)的哮喘小鼠ASMCs增殖的影響
　　體外IL-13與ASMCs共培養(yǎng)，MTT法檢測各組細(xì)胞增殖情況得出，IL-13在體外可誘導(dǎo)ASMCs發(fā)生增殖，而VIP干預(yù)組細(xì)胞增殖減弱，提示VIP可抑制體外IL-13誘導(dǎo)的ASMCs增殖，且此抑制作用與VIP的作用時間及作用濃度有關(guān)。
　　應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞周期變化，得出VIP可影響ASMCs的細(xì)胞周期，使大部分細(xì)胞處于G0/G1期，S期比例降低

17、，從而抑制ASMCs增殖。
　　3、ERK1/2信號通路/Cav-1在VIP對IL-13誘導(dǎo)的ASMCs增殖中的作用
　　體外應(yīng)用IL-13誘導(dǎo)ASMCs增殖，并給予干預(yù)因素，Western blot檢測蛋白表達(dá)，結(jié)果表明，哮喘ASMCs Cav-1表達(dá)減少，p-ERK1/2比例增加;VIP治療組Cav-1表達(dá)增加，p-ERK1/2比例降低;PD98059阻斷ERK1/2信號通路后，Cav-1表達(dá)增加，p-ERK1/2比例降

18、低。提示VIP抑制體外培養(yǎng)的IL-13誘導(dǎo)的ASMCs增殖作用與ERK1/2信號通路及Cav-1蛋白表達(dá)有關(guān)。
　　結(jié)論：
　　1、哮喘氣道重塑小鼠肺組織VIP及VIPR1蛋白及mRNA表達(dá)均明顯減少，給予VIP治療可在一定程度上減輕氣道平滑肌增厚。
　　2、VIP可以抑制體外培養(yǎng)的ASMCs增殖，且與其作用濃度及時間相關(guān)。
　　3、VIP可通過影響ASMCs細(xì)胞周期而抑制其增殖。
　　4、VIP可能通過抑