江豚Neophocaena phocaenoides單核苷酸多態(tài)性位點SNPs篩選的方法學研究.pdf

1、本論文共包括四個部分： 1)綜述了單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms，SNPs)標記及其在生態(tài)、進化和種群生物學中的應用。 2)構建江豚(Neophocaena phocaenoides)的基因組霰彈槍法文庫(whole-genome shotgun library)，通過克隆測序獲得了83個序列。根據(jù)這些序列設計了68對引物，其中63對能進行成功的PCR擴增。通過63對引物在

2、24個江豚個體中擴增產(chǎn)物的變性高效液相色譜(denaturing high performanceliquid chromatography，DHPLC)分析，發(fā)現(xiàn)其中20對引物的擴增產(chǎn)物呈現(xiàn)多態(tài)，并通過測序驗證確定其中18個擴增產(chǎn)物中含有SNPs。通過進一步的篩選，共確定29個SNPs，其中顛換7個，轉換21個，插入/缺失1個。盡管DHPLC分析時的假陽性率為lO％左右，但構建基因組文庫結合DHPLC的方法仍可以用于非模式生物SNPs

3、的大規(guī)模篩選。 3)選擇2個已知的江豚SNPs，將擴增產(chǎn)物按基因頻率制備成0-50％的11個DNA池(DNA pooling)，分別用于直接測序和DHPLC分析，以探討兩種方法檢測SNPs時的效率及制備DNA池時對基因頻率的要求。結果發(fā)現(xiàn)，當?shù)任换虻念l率不少于12.5％時可在DHPLC分析時能予以明確地分辨，但當用DNA池進行直接測序時則頻率需要達到20％。這提示，為保證DHPLC分析的準確性，制備DNA池時等摩爾DNA混合的

4、樣品數(shù)應盡量不超過4個。DNA池結合DHPLC技術的高效性與準確性可在大規(guī)模的SNPs位點篩選中發(fā)揮作用。 4)通過比較錨定序列示蹤(comparative anchor tagged sequences，CATS)法，選擇人、小鼠及其它哺乳動物中已知的5對CATS引物，通過PCR反應從江豚基因組中擴增出相應的DNA片段，結合DHPLC和DNA直接測序等技術，進行江豚單核苷酸多態(tài)性位點的篩選。通過不同個體同源序列的比對分析，發(fā)現(xiàn)