基于隨機(jī)突變體構(gòu)建的克羅諾桿菌逆境相關(guān)基因的發(fā)掘研究.pdf

1、克羅諾桿菌是一種兼性厭氧革蘭氏陰性菌，通常以嬰幼兒配方奶粉為主要感染渠道，對(duì)嬰幼兒的身體健康造成嚴(yán)重危害。該菌可引起新生兒細(xì)菌性腦膜炎、壞死性小腸結(jié)腸炎和菌血癥等，且致死率高達(dá)40％-80％。克羅諾桿菌分布廣泛且嚴(yán)重危害某些特定人群（如新生兒）生命而被廣泛關(guān)注?？肆_諾桿菌的抗逆性很強(qiáng)，而目前對(duì)克羅諾桿菌抗逆性的相關(guān)基因研究鮮有報(bào)道。
　　本課題以丙二酸鹽克羅諾桿菌野生株為主要研究對(duì)象，通過(guò)質(zhì)粒結(jié)合轉(zhuǎn)移的方法構(gòu)建克羅諾桿菌的突變體庫(kù)

2、。基于突變株和野生株在不同逆境脅迫下（滲透壓脅迫、氧化應(yīng)激脅迫、干燥脅迫、酸脅迫）生長(zhǎng)情況，篩選出具有代表性的不同逆境耐受突變株;通過(guò)隨機(jī)PCR反應(yīng)及數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)確定其突變位點(diǎn)。在此基礎(chǔ)上，開(kāi)展結(jié)晶紫染色測(cè)量突變株和野生株生物膜形成能力實(shí)驗(yàn)研究，并借助激光共聚焦和掃描電子顯微鏡表征逆境脅迫下野生株和突變株的生物膜微觀變化。結(jié)果表明，1.滲透壓脅迫相關(guān)因子包括:內(nèi)膜蛋白YhjD、鉀離子外流蛋白KefA、肽基輔氨酰異構(gòu)酶、半胱氨酸-tRNA復(fù)

3、合結(jié)構(gòu)脫酰基酶、寡聚半乳酸裂解酶;2.干燥脅迫相關(guān)因子包括:葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶、糖基水解酶、海藻糖-6-磷酸合酶、外膜蛋白A、碳磷裂解酶復(fù)合物亞基團(tuán);3.氧化應(yīng)激脅迫相關(guān)因子包括:泛酰酸激酶、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶、丙酮酸激酶、磷脂酶A、丙氨酸消旋酶2、鐵離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白A、硫氧還蛋白2和谷氧還蛋白3;4.酸脅迫相關(guān)基因包括:葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶MdoH、胞外絲氨酸蛋白酶、硫酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體、磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體亞基，并且發(fā)現(xiàn)除了糖基水解酶之外，其他突變株