線粒體標志分子COXⅣ和HSP60在肝癌的表達分析及功能研究.pdf

1、肝癌是居全球第三位、居我國第二位的癌癥死因,已成為我國公共衛(wèi)生難題,嚴重危害我國國民身體健康。盡管肝癌的臨床診療研究已經(jīng)取得了很大進步,但是目前的肝癌分期系統(tǒng)仍然不能精確預(yù)測肝癌預(yù)后,因此篩選鑒定新的肝癌相關(guān)分子標志物,系統(tǒng)闡明其在肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用機制,對于深入理解肝癌分子生物學特性、指導臨床預(yù)后判斷和治療決策以及開發(fā)新的防治策略具有重要意義。線粒體是真核細胞中唯一具有獨立基因組的細胞器,在能量代謝、細胞凋亡、ROS產(chǎn)生以及鈣穩(wěn)態(tài)調(diào)

2、控等生命活動中發(fā)揮著極其關(guān)鍵的作用。近年來,線粒體與腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)系日益受到重視,線粒體異常改變可影響腫瘤細胞多方面的生物學特性。細胞色素c氧化酶(cytochrome c oxidase,COX)是線粒體氧化呼吸鏈電子傳遞的最后環(huán)節(jié),由13個亞單位構(gòu)成,其中亞單位IV(COX IV)是COX組裝的關(guān)鍵分子,定位在線粒體內(nèi)膜上,可作為線粒體的分子標志物。以往的研究表明,COX亞單位表達異?？娠@著影響腫瘤細胞的增殖、侵襲和耐藥能力,但是

3、 COX IV在肝癌表達及其臨床意義尚未見報道。熱休克蛋白60(heat shock protein60,HSP60)是由核基因組編碼的線粒體分子伴侶蛋白,對于線粒體內(nèi)蛋白的轉(zhuǎn)運、折疊具有重要作用,是線粒體的另一個重要標志物。大量研究表明多種腫瘤中HSP60的表達水平發(fā)生了異常改變,而且HSP60表達水平與腫瘤的臨床特點和預(yù)后密切相關(guān),但是其在肝癌中的表達及臨床意義尚無研究,其對肝癌細胞生物學特性的影響亦無報道。
　　【目的】

4、r>　　本課題以肝癌為研究對象,選擇兩個線粒體標志分子COX IV和HSP60,分別檢測了它們在肝癌中的表達水平,分析其臨床意義,并初步探索HSP60對肝癌細胞生物學特性的影響。
　　【方法】
　　1.COX IV在肝癌的表達檢測:利用real-time PCR檢測COX IV mRNA在24例肝癌及對應(yīng)癌旁組織中的表達,利用免疫組化進一步在323例肝癌及對應(yīng)癌旁組織驗證COX IV蛋白表達,并分析COX IV表達水平與肝癌

5、臨床病理學參數(shù)和預(yù)后的相關(guān)性。
　　2.HSP60在肝癌的表達檢測:利用real-time PCR和Western blot分別檢測HSP60 mRNA和蛋白在24例肝癌及對應(yīng)癌旁組織中的表達,利用免疫組化進一步在331例肝癌及對應(yīng)癌旁組織驗證HSP60蛋白表達,并分析HSP60表達水平與肝癌臨床病理學參數(shù)和預(yù)后的相關(guān)性。利用real-time PCR、Western blot和免疫熒光染色檢測HSP60在肝癌細胞系中的表達。

6、r>　　3.構(gòu)建pcDNA3.1-HSP60表達載體,設(shè)計并合成HSP60特異性干擾片段,利用陽離子脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染肝癌細胞系,分別檢測過表達和干擾HSP60后,肝癌細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲能力的變化。
　　【結(jié)果】
　　1.COX IV在肝癌中的表達及其臨床意義:(1)real-time PCR結(jié)果顯示COX IV在肝癌組織中的mRNA表達水平顯著低于癌旁組織(P<0.05),免疫組化分析進一步證實COX IV蛋白在肝癌細胞

7、中的表達水平顯著下降(P<0.001)。(2)COX IV表達與患者血清HBsAg(P=0.045)、AFP(P=0.012)和腫瘤分化程度(P=0.030)等臨床病理學參數(shù)顯著相關(guān)。(3)COX IV表達水平與肝癌患者無復發(fā)生存顯著相關(guān),高表達患者的無復發(fā)生存顯著優(yōu)于低表達患者(P=0.024)。(4)COX IV低表達患者發(fā)生門靜脈癌栓的風險大大增加(OR=2.323;95％CI(1.044-5.169);P=0.039)。

8、　　2.HSP60在肝癌中的表達及其臨床意義:(1)real-time PCR結(jié)果顯示HSP60在肝癌組織中的mRNA表達水平顯著低于癌旁組織(P=0.006),免疫組化分析進一步證實HSP60蛋白在肝癌細胞中的表達水平顯著下降(P=0.0003),Western blot檢測也表明HSP60蛋白在肝癌細胞中表達下降。(2)免疫熒光染色顯示HSP60主要表達于肝癌細胞質(zhì)內(nèi),real-time PCR和Western blot檢測表明肝癌

9、細胞系BEL-7402和HepG2 HSP60表達水平較高,而SMMC7721、Huh7和SK-HEP1表達水平較低。(3)HSP60表達與患者血清AFP(P<0.001)和腫瘤分化程度(P=0.006)顯著相關(guān)。(4)HSP60表達水平與肝癌患者術(shù)后總生存和無復發(fā)生存無顯著相關(guān)性。
　　3.HSP60對肝癌生物學特性的影響:過表達 HSP60可顯著促進肝癌細胞系SK-HEP1凋亡(P<0.05),抑制細胞遷移(P<0.05)和侵

10、襲(P<0.05),但對細胞增殖無顯著影響;干擾HSP60表達可顯著抑制肝癌細胞系BEL-7402凋亡(P<0.05),促進細胞遷移(P<0.05)和侵襲(P<0.05),但對細胞增殖不顯著相關(guān)。
　　【結(jié)論】
　　1.肝癌細胞中線粒體標志分子COX IV和HSP60表達均下降,提示肝癌發(fā)生發(fā)展過程中線粒體生成可能存在異常改變。
　　2.COX IV表達下降在肝癌的發(fā)生發(fā)展中可能起重要作用,COX IV的表達可作為肝癌