胞外HSP60誘導(dǎo)心肌表達(dá)炎癥因子的作用與機(jī)制研究.pdf

1、熱休克蛋白60（heatshockprotein60,HSP60）在生理狀態(tài)下位于細(xì)胞內(nèi)，對維持細(xì)胞的正常功能不可或缺，并對細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)具有保護(hù)作用。在細(xì)胞受到缺血等刺激因素作用下，HSP60可“主動(dòng)”分泌出胞或者由壞死細(xì)胞釋放到細(xì)胞外。有研究表明，胞外HSP60能夠激活免疫細(xì)胞胞膜中的toll樣受體（toll-likerecepors,TLRs）-4而引起炎癥反應(yīng)。心肌細(xì)胞中也有TLRs分布，但是胞外HSP60是否可能激活心肌細(xì)胞TL

2、Rs而直接引起心肌炎癥反應(yīng)尚不明確。本課題在消化分離的成年大鼠心肌細(xì)胞和培養(yǎng)的大鼠H9C2心肌細(xì)胞模型，研究了外源性H9C2刺激炎癥因子表達(dá)的作用，并探討了其作用機(jī)制。
　　研究目的：
　　明確胞外HSP60直接刺激心肌炎癥因子表達(dá)的作用，并探討心肌細(xì)胞TLRs受體在其中的介導(dǎo)作用及其信號通路。在心肌缺血等病理生理狀態(tài)下，HSP60異常出胞，可能成為HSP60引起無菌性炎癥反應(yīng)的內(nèi)源性因子，本課題研究有助于為認(rèn)識缺血心肌發(fā)生

3、無菌性炎癥反應(yīng)的機(jī)制提供線索。
　　研究方法：
　　1、通過結(jié)扎成年雄性SD大鼠冠狀動(dòng)脈左前降支（leftanteriordescendingcoronaryartery，LAD），建立心臟缺血模型。取假手術(shù)或者冠脈結(jié)扎所致心肌缺血的大鼠心臟，通過在Langendorff系統(tǒng)上進(jìn)行離體心臟左心室逆行灌流，膠原酶消化分離獲得心肌細(xì)胞。給予HSP60刺激，通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測TNF、IL-6、TLR2/TLR4mRNA的

4、表達(dá)量變化；ELISA法檢測細(xì)胞培液上清中的炎癥因子TNF、IL-6的含量；比色法檢測細(xì)胞培液上清中的LDH活性以分析心肌細(xì)胞損傷情況。
　　2、按常規(guī)培養(yǎng)H9C2大鼠心肌細(xì)胞系，給予HSP60刺激，通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測TNF-а、IL-6、TLR2、TLR4mRNA的表達(dá)量變化；ELISA法檢測細(xì)胞培液上清中的炎癥因子TNF-а、IL-6的含量；westernblot法檢測TLR2和TLR4受體蛋白表達(dá)量。應(yīng)用TLR2/

5、TLR4特異性抗體或者轉(zhuǎn)染siRNA來阻斷TLR2/TLR4，觀察如何影響HSP60的致炎效應(yīng)。并且，通過細(xì)胞免疫熒光法檢測HSP60是否引起P65發(fā)生核轉(zhuǎn)位，從而判斷HSP60是否激活了致炎轉(zhuǎn)錄因子NF-kB。
　　結(jié)果
　　1、以外源性HSP60孵育酶解分離獲得的成年大鼠心肌細(xì)胞，炎性細(xì)胞因子TNF-a和IL-6的表達(dá)以及釋放均明顯上調(diào)。當(dāng)給予HSP601ug/ml孵育3h后，假手術(shù)組心肌細(xì)胞TNF-а和IL-6mRNA

6、表達(dá)量分別上調(diào)1.76±0.13和1.89±0.09倍；LAD結(jié)扎組心肌細(xì)胞TNF-а和IL-6mRNA表達(dá)量分別上調(diào)3.07±0.11和3.35±0.18倍。給予HSP605ug/ml孵育3h后，假手術(shù)組心肌細(xì)胞TNF-а和IL-6mRNA表達(dá)量分別上調(diào)2.04±0.12和2.46±0.13倍；LAD結(jié)扎組TNF-а和IL-6mRNA表達(dá)量分別上調(diào)3.97±0.13和4.28±0.17倍；HSP60引起的TNF-а和IL-6mRNA表

7、達(dá)上調(diào)均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。并且，HSP60引起TNF-а和IL-6釋放量顯著增加。HSP601ug/ml孵育3h，假手術(shù)組TNF-а和IL-6釋放量分別是84.5±6.8和72.7±3.7pg/ml，顯著高于未給藥組（63.1±5.2和53.6±4.5pg/ml，P＜0.05）；LAD結(jié)扎組TNF-а和IL-6釋放量分別是98.6±7.9和90.6±7.4pg/ml，顯著高未給藥組（90.8±6.5和78.6±4.4pg/ml，P＜0.05

8、）。當(dāng)給予高劑量HSP60(5ug/ml),假手術(shù)組TNF-а和IL-6釋放量進(jìn)一步升高，分別是112.7±6.2和95.7±4.7pg/ml,LAD結(jié)扎組TNF-а和IL-6釋放量也進(jìn)一步升高，分別是137.6±8.0和132.4±6.8pg/ml。
　　2、以外源性HSP60孵育培養(yǎng)的H9C2心肌細(xì)胞，細(xì)胞因子TNF-а和IL-6的表達(dá)以及釋放也明顯上調(diào)。HSP601ug/ml處理組炎癥因子TNF-а和IL-6mRNA表達(dá)量分

9、別上調(diào)1.42±0.06和1.69±0.11倍；HSP605ug/ml處理組TNF-а和IL-6mRNA表達(dá)量分別上調(diào)1.87±0.13和2.25±0.12倍，與未給藥組相比均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。TLR2和TLR4mRNA表達(dá)顯著上調(diào)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。Westernblot結(jié)果顯示TLR4蛋白表達(dá)量在HSP60處理后3h顯著升高，12h達(dá)到最好，24h仍然高。此外，對細(xì)胞培液上清中LDH活性檢測的結(jié)果顯示，LDH的釋放量在HSP

10、60處理后24h內(nèi)呈遞增趨勢，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。
　　3、用TLR4特異性抗體阻斷TLR4受體后，H9C2細(xì)胞培液上清中炎癥因子TNF和IL-6釋放量分別為25.8±4.9和33.9±4.5pg/ml，兩者均顯著低于HSP60處理組的釋放量（54.1±4.7和60.7±4.1pg/ml，P＜0.05）。該結(jié)果提示TLR4參與介導(dǎo)了HSP60的致炎效應(yīng)。
　　4、在培養(yǎng)的H9C2心肌細(xì)胞，細(xì)胞免疫熒光法觀察到炎性轉(zhuǎn)

11、錄因子NF-кB的亞單位P65在外源性HSP60處理后從細(xì)胞漿轉(zhuǎn)位進(jìn)入細(xì)胞核（NF-кB是TLRs受體下游的關(guān)鍵信號分子）。表明HSP60激活了NF-кB。
　　結(jié)論
　　1、胞外的HSP60能夠直接誘導(dǎo)心肌細(xì)胞產(chǎn)生炎癥因子TNF-a和IL-6。
　　2、HSP60引起TLR2和TLR4受體表達(dá)上調(diào)。
　　3、TLR4抗體能夠有效抑制HSP60的致炎效應(yīng)，提示TLR4參與介導(dǎo)了HSP60的致炎效應(yīng)。TLR4可能作