應(yīng)用組織工程技術(shù)構(gòu)建復(fù)合層兔角膜組織的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、上海第二醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文應(yīng)用組織工程技術(shù)構(gòu)建復(fù)合層兔角膜組織的實(shí)驗(yàn)研究姓名：王愛麗申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：碩士專業(yè)：整形外科學(xué)指導(dǎo)教師：劉偉20040401上海第=醫(yī)科大學(xué)2001級(jí)碩士畢業(yè)論文應(yīng)用組織工程技術(shù)構(gòu)建復(fù)合層兔角膜組織的實(shí)驗(yàn)研究中文摘要目的：角膜病變是導(dǎo)致失明的常見原因，目前臨床上唯一可靠、有效的治療方法是角膜移植。角膜供體來源缺乏和免疫排斥反應(yīng)是限制角膜移植手術(shù)開展的兩大難題。組織工程技術(shù)的興起和發(fā)展為解決上述問題提供了一條可行

2、的新途徑。組織工程化角膜的研究，開展至今已取得了長(zhǎng)足的進(jìn)步。從以往的體外單層組織構(gòu)建的基礎(chǔ)上，正逐漸向三維體系的多層結(jié)構(gòu)深入。種子細(xì)胞來源的研究也日益受到關(guān)注。本課題以角膜緣上皮干細(xì)胞和角膜基質(zhì)細(xì)胞為研究基礎(chǔ)，應(yīng)用組織工程學(xué)的技術(shù)方法，結(jié)合以往的研究成果，尋找一種構(gòu)建復(fù)合層角膜組織的有效方法。方法：1)角膜緣上皮于細(xì)胞的培養(yǎng)、擴(kuò)增及鑒定沿兔角膜緣上側(cè)于顯微鏡下分離切取l4mm角膜緣上皮組織，消化法獲得角膜緣上皮細(xì)胞，接種于絲裂霉素處理過

3、的3T3飼養(yǎng)層細(xì)胞上培養(yǎng)及擴(kuò)增。觀察克隆形成情況及細(xì)胞形態(tài)以及超微結(jié)構(gòu)；進(jìn)行克隆分析及克隆形成率的測(cè)定；用免疫組化及免疫熒光的方法檢測(cè)角蛋白K3、p63、PCNA等角膜上皮干細(xì)胞及成熟細(xì)胞特異性標(biāo)記物的表達(dá)；用WesternBlotting的方法，從蛋白水平檢測(cè)各標(biāo)記物的表達(dá)情況。應(yīng)用端粒酶活性檢測(cè)法比較角膜緣上皮干細(xì)胞與中央上皮細(xì)胞的端粒酶活性。2)角膜基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)擴(kuò)增及檢測(cè)手術(shù)顯微鏡下解剖分離角膜基質(zhì)組織，酶消化法獲得細(xì)胞，體外培養(yǎng)