尼古丁對原代人支氣管平滑肌細(xì)胞及成纖維細(xì)胞作用的初步研究.pdf

1、【研究背景】：
　　氣道重塑是COPD不可逆性氣流受限的主要原因及重要的病理基礎(chǔ)，結(jié)果可引起氣道阻塞和肺彈性回縮力下降，在氣流受限中扮演著非常重要的角色。吸煙是引起COPD的主要原因，一般認(rèn)為，煙草煙霧通過引起氣道炎癥、氧化/抗氧化失衡、蛋白酶/抗蛋白酶失衡和細(xì)胞凋亡等多方面參與COPD的發(fā)病過程[1]。
　　香煙煙霧成分十分復(fù)雜，其引起COPD的機(jī)制仍不清；而尼古丁占煙草生物堿總量的95％以上，是香煙煙霧中最主要的有害成分

2、之一[2]，尼古丁是煙草中的主要致成癮成分，臨床將其作為香煙替代物用于戒煙治療[3]。但是，迄今為止，煙草煙霧中的尼古丁是否直接對成人肺組織造成不利影響鮮見報(bào)道。我們推測，其對COPD發(fā)病，特別是對氣道重塑有著重要的影響。
　　支氣管平滑肌細(xì)胞的增殖、表型的轉(zhuǎn)換及成纖維細(xì)胞的活化、增生等病理生理改變在COPD氣道重塑起關(guān)鍵作用。因此，尼古丁對成人肺組織中尤其是支氣管平滑肌細(xì)胞及成纖維細(xì)胞的作用值得研究。本實(shí)驗(yàn)通過初步研究尼古丁單一

3、成分對原代人支氣管平滑肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的致病作用，初步探討尼古丁在COPD氣道重塑的發(fā)生發(fā)展過程中的作用及機(jī)制，為COPD的防治提供新的思路。
　　第一部分：應(yīng)用基因芯片觀察尼古丁對原代人支氣管平滑肌細(xì)胞基因表達(dá)譜的變化
　　目的：
　　利用基因芯片技術(shù)從mRNA水平初步觀察尼古丁對原代人支氣管平滑肌細(xì)胞作用后的全基因組表達(dá)譜的變化，初步探索尼古丁對人支氣管平滑肌細(xì)胞的作用。
　　方法：
　　1.購買原代

4、人支氣管平滑肌細(xì)胞，復(fù)蘇后常規(guī)傳代培養(yǎng)。
　　2.實(shí)驗(yàn)分組：分兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)24h及72h，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)各有兩組：尼古丁處理組（1310-5 M）及空白對照組（不含尼古?。?，每組均設(shè)兩個(gè)平行組。
　　3.細(xì)胞處理完畢后分別提取各組細(xì)胞的總 RNA，進(jìn)行 Roche-NimbleGene人類全基因組表達(dá)譜芯片實(shí)驗(yàn)。
　　4.分別對尼古丁組及空白對照組間的基因差異表達(dá)譜進(jìn)行生物信息學(xué)分析，對差異表達(dá)的基因進(jìn)行GO和pathway

5、分析。
　　結(jié)果：
　　1.尼古丁處理24h后，表達(dá)上調(diào)2倍以上的基因有150個(gè)，表達(dá)下調(diào)2倍以上的基因有162個(gè)。
　　2.尼古丁處理72h后，表達(dá)上調(diào)2倍以上的基因有268個(gè)，表達(dá)下調(diào)2倍以上的基因有518個(gè)。
　　3.對差異基因進(jìn)行 GO分析和Pathway分析，發(fā)現(xiàn)差異基因覆蓋細(xì)胞分裂（cell division）、細(xì)胞周期（Cell cycle）、細(xì)胞骨架（cytoskeleton）、肌肉收縮（musc

6、le contraction）、鈣依賴陽離子通道活性（calcium activated cation channel activity）防御反應(yīng)（defense response）、免疫反應(yīng)（immune response）等多種基因功能類別（GO Terms），以及鈣信號通路（Calcium signaling pathway）、DNA復(fù)制（DNA replication）、細(xì)胞周期（cell cycle）、B細(xì)胞受體信號通路、T細(xì)

7、胞受體信號通路及腫瘤通路（Pathways in cancer）等相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路（PA）。
　　第二部分：尼古丁誘導(dǎo)原代人支氣管成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化
　　目的：
　　觀察尼古丁誘導(dǎo)人支氣管成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的影響，探討尼古丁在COPD氣道重塑中的作用。
　　方法：
　　1.體外原代培養(yǎng)人支氣管成纖維細(xì)胞。
　　2.光鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)及利用細(xì)胞免疫熒光法對細(xì)胞進(jìn)行鑒定。
　

8、　3.實(shí)驗(yàn)分組：空白對照組（不含尼古?。?、尼古丁低濃度組（1310－8 M）、尼古丁高濃度組（1310－5 M）和陽性對照組[轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TGF-β1）2.5μg/L]。分別處理96h。
　　4.采用Western blot法檢測各組細(xì)胞中α-SMA的表達(dá)。
　　5.采用細(xì)胞免疫熒光法檢測各組α-SMA的表達(dá)及觀察細(xì)胞表型的變化。
　　結(jié)果：
　　1.細(xì)胞免疫熒光鑒定波形蛋白陽性，成功原代培養(yǎng)出人支氣管成

9、纖維細(xì)胞。
　　2. Western blot法檢測各組α-SMA表達(dá)的相對含量示尼古丁高濃度組
　?。?.56±0.05）、尼古丁低濃度組（0.46±0.12）和陽性對照組（1.08±0.08）均顯著高于空白對照組（0.36±0.04），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=121.10，P<0.05）；
　　3.與空白對照組相比，陽性對照組及尼古丁組細(xì)胞變肥大且出現(xiàn)明顯的肌絲樣改變。
　　【結(jié)論】：
　　1.尼古丁能引