木材煙霧凝集物對人氣道平滑肌細胞作用的初步研究.pdf

1、【研究背景】
　　我們的前期流行病學調查研究發(fā)現(xiàn),生物燃料暴露也是導致慢性阻塞性肺疾病(簡稱:慢阻肺)的重要危險因素之一。近年來發(fā)現(xiàn),氣道平滑肌細胞作為氣道的主要結構細胞之一,不僅可以通過細胞數目增多、體積增大來參與氣道壁增厚,而且在外界因素,如炎癥介質、氧化因子等的刺激下,還發(fā)揮自分泌和旁分泌功能,影響周圍的結構細胞和炎癥細胞。氣道平滑肌層的增厚是氣道重塑的重要病理改變,上皮下基質增多、上皮下纖維化也參與了慢阻肺氣道的重塑。氣道

2、平滑肌細胞的增殖與凋亡、甚至由壞死而引起的強烈炎癥反應共同參與了氣道的損傷與修復,最終引起氣道結構的不可逆重塑。初步研究體外暴露生物燃料凝集物對氣道平滑肌細胞的效應如何,對進一步明確生物燃料致慢阻肺機制的基礎研究有重要指導意義。
　　【目的】
　　通過細胞增殖檢測技術觀察特定濃度木材煙霧凝集物(WSC)處理后的人氣道平滑肌細胞的增殖效應,并利用Q-PCR和Western blot檢測細胞周期蛋白1(cyclin D1)的含量

3、變化,分析影響細胞增殖的分子機制。通過觀察細胞形態(tài)和數目變化,膜聯(lián)蛋白-Ⅴ(Annexin-Ⅴ)和碘化丙啶(PI)凋亡和壞死檢測技術,觀察WSC處理后人氣道平滑肌細胞的壞死和凋亡效應。
　　【方法】
　　一、購買的原代人氣道平滑肌細胞復蘇傳代培養(yǎng),2-8代細胞用于實驗。實驗分組:空白對照組、WSC刺激組、CSC刺激組,WSC和CSC的刺激濃度經CCK8細胞毒性實驗初步確定細胞活力增殖范圍,以及細胞增殖抑制初始濃度。
　

4、　二、WSC對HASMCS增殖效應的影響:細胞培養(yǎng)和處理24小時后,EDU實驗和流式細胞儀分析細胞周期檢測細胞增殖效應;Q-PCR和Western blot技術檢測各組細胞cyclinD1的含量變化。
　　三、WSC對HASMCS壞死和凋亡的影響:不同濃度的凝集物刺激下,光學顯微鏡觀察細胞形態(tài)變化,細胞計數儀計數細胞數目。細胞早期凋亡和壞死鑒別試劑膜聯(lián)蛋白-Ⅴ(Annexin-Ⅴ)和碘化丙啶(PI),貼壁共染細胞,熒光顯微鏡下計數

5、凋亡和壞死細胞比例。
　　【結果】
　　一、在WSC1μg/ml、CSC10μg/ml時,細胞活性分別為[(126±12)％、(142±11)%],較空白對照組[(100±0)%]明顯增加,此時出現(xiàn)細胞活性增殖峰,q值分別為9.33和6.24,P<0.05。暴露劑量達到WSC10μg/ml、CSC60μg/ml時,細胞活性被抑制,分別為85.67%、75.85%,較空白對照組顯著降低,q值分別為5.19和3.63,P<0.0

6、5。
　　二、WSC1μg/ml刺激組細胞增殖指標中的細胞增殖比例和cyclin D1蛋白灰度相對值[(123±20)%,1.31±0.64]顯著高于空白對照[(100±0)%,1.0±0.0],q值分別為5.85和5.91,P<0.05;而S+G2M期細胞比例和cyclin D1 mRNA表達量[(102±4)%、1.18±0.21]較未處理組[(100±0%),1.0±0.0]無顯著差異,P值均>0.05。CSC10μg/ml

7、組的細胞增殖比例、S+G2M期比例、cyclinD1mRNA和蛋白灰度分別為[(204±45)%、(140±6)%、1.48±0.27和1.80±0.25],均顯著大于對照組,q值分別為11.87、16.51、5.38和15.06,同時也高于WSC1μg/ml組,q值分別為9.41、15.35、3.33和9.15,P值均<0.05。
　　三、WSC10μg/ml刺激時,壞死細胞比例增加為[(13.39±0.15)%],高于空白對照

8、組[(1.57±0.41)%]和CSC60μg/ml組[(6.61±1.91)%],q值分別為18.03和10.34,P<0.05;而CSC40μg/ml刺激時,凋亡細胞比例增多為[(61.8±10.6)%],高于空白對照組[(0.0±0.0)%]和WSC10μg/ml組[(1.7±0.4)%],q值分別為17.44和16.95,P均<0.05。
　　【結論】
　　體外暴露木材煙霧凝集物對氣道平滑肌細胞的作用效應與體外暴露于