哇巴因誘導(dǎo)Raji細(xì)胞凋亡和自噬機(jī)制的研究.pdf

1、[目的]
　　研究強(qiáng)心苷類藥物哇巴因?qū)τ谌薆urkitt's淋巴瘤細(xì)胞株Raji細(xì)胞抑制增殖、誘導(dǎo)凋亡和自噬的作用及其作用機(jī)制。
　　[方法]
　　以不同濃度(25 nM、50 nM、100 nM)哇巴因作用于Raji細(xì)胞，采用CCK-8法檢測哇巴因?qū)aji細(xì)胞和正常人骨髓單個核細(xì)胞(BM-MNCs)的增殖抑制作用;應(yīng)用光鏡和Annexin V-FITC/PI雙染法觀察Raji細(xì)胞形態(tài)，檢測細(xì)胞凋亡率，Western

2、 Blot法檢測cleaved-caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)水平的變化;通過透射電鏡(TEM)、單丹磺酰戊二胺(MDC)染色法檢測Raji細(xì)胞自噬，Western Blot法檢測Beclin-1、LC3和PI3K/AKT/mTOR通路蛋白表達(dá)水平的變化。
　　[結(jié)果]
　　1.哇巴因呈濃度依賴性地抑制Raji細(xì)胞增殖。25 nM、50 nM、100 nM哇巴因?qū)aji細(xì)胞的增殖抑制率分別為23.23±2.

3、20％、32.20±4.09％和58.86±5.78％，各濃度組的抑制率具有顯著性差異(P＜0.05)。哇巴因作用于Raji細(xì)胞48h的IC50值為76.48nM。而同等濃度哇巴因?qū)θ薆M-MNCs的增殖抑制率分別為5.44±0.91％、7.86±1.26％和17.31±1.55％，與Raji細(xì)胞相比，抑制率均有顯著性差異(P＜0.05)。
　　2.哇巴因可誘導(dǎo)Raji細(xì)胞凋亡。光鏡下可觀察到Raji細(xì)胞出現(xiàn)胞漿空泡化、細(xì)胞膜皺縮

4、、染色質(zhì)增粗、濃集和邊聚等凋亡形態(tài)學(xué)改變;25 nM、50nM、100nM濃度的哇巴因作用Raji細(xì)胞48h后，Raji細(xì)胞早期凋亡率、晚期凋亡率和總凋亡率總體隨著哇巴因作用濃度的升高而增高，僅100 nM哇巴因組早期凋亡率低于50 nM哇巴因組;除25 nM哇巴因組Raji細(xì)胞早期凋亡率與對照組無明顯差異外(P＞0.05)，其余各實(shí)驗(yàn)組早期凋亡率、晚期凋亡率和總凋亡率與對照組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。隨著哇巴因作用濃度

5、的升高，cleaved-caspase-3蛋白的表達(dá)明顯增強(qiáng)，Bax/Bcl-2比值增加，與對照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　3.哇巴因可誘導(dǎo)Raji細(xì)胞自噬。TEM下可觀察到Raji細(xì)胞胞漿中出現(xiàn)許多雙層膜結(jié)構(gòu)，包裹胞漿成分和線粒體等細(xì)胞器，形成自噬體、自噬溶酶體等典型的自噬形態(tài)學(xué)改變;MDC染色法可觀察到，以25 nM、50nM、100 nM哇巴因作用于Raji細(xì)胞，熒光染色的細(xì)胞數(shù)量隨作用濃度增加而逐漸增

6、加，且細(xì)胞核周區(qū)域出現(xiàn)了較強(qiáng)的點(diǎn)塊狀熒光顆粒。隨著哇巴因作用濃度的升高，Beclin-1表達(dá)明顯增強(qiáng)，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值增加，與對照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);PI3K/AKT/mTOR通路蛋白及其下游底物S6K1和4EBP1蛋白磷酸化水平呈下降趨勢，其中50nM和100 nM哇巴因組與對照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　[結(jié)論]
　　1.100 nM以下哇巴因?qū)aji細(xì)胞具有明顯