多氯聯(lián)苯醌誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生自噬以及自噬-凋亡轉(zhuǎn)換的機(jī)制分析.pdf

1、多氯聯(lián)苯（PCBs）是一類無(wú)所不在的持久性有機(jī)污染物，由于其多種毒性效應(yīng)如內(nèi)分泌毒性、免疫毒性、神經(jīng)毒性等，在二十世紀(jì)七十年代已被禁止使用，但是由于其特殊的理化及生物學(xué)特性，PCBs仍然廣泛存在于我們的環(huán)境包括陸地和水生系統(tǒng)。細(xì)胞自噬是細(xì)胞內(nèi)受損衰老的蛋白質(zhì)或者細(xì)胞器包裹起來(lái)形成自噬體，自噬體再與溶酶體融合進(jìn)而進(jìn)行消化降解的過(guò)程，也常被作為細(xì)胞的自我保護(hù)機(jī)制。該研究的目的是為了分析PCB29-pQ激活自噬的具體機(jī)制，以及探討細(xì)胞自噬與細(xì)

2、胞凋亡間的轉(zhuǎn)換機(jī)制。本研究分為三個(gè)部分：
　　第一部分：研究考察了多氯聯(lián)苯醌通過(guò)mTOR/p70S6k誘導(dǎo)細(xì)胞自噬發(fā)生的分子機(jī)制。選用 HepG2和 MDA-MB-231細(xì)胞作為研究對(duì)象，并通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)PCB29-pQ誘導(dǎo)的自噬沒(méi)有細(xì)胞特異性。首先，兩種細(xì)胞在5μM PCB29-pQ處理24 h后透射電鏡檢測(cè)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)顯示出自噬泡顯著特征，并通過(guò)AO染色、MDC染色觀察到明顯的自噬泡形成，由此先從形態(tài)學(xué)和生化特征表明 PCB29

3、-pQ作用后可以引起細(xì)胞發(fā)生自噬。然后從自噬體形成的3個(gè)階段證明誘導(dǎo)自噬發(fā)生的分子機(jī)制。第一階段從濃度和時(shí)間梯度上分別檢測(cè)了對(duì)自噬開(kāi)關(guān)負(fù)調(diào)控的蛋白mTOR和p70S6k的表達(dá)，在PCB29-pQ作用后其蛋白表達(dá)水平降低，表明激活了自噬的誘導(dǎo)階段。第二階段檢測(cè)了自噬體形成過(guò)程中自噬相關(guān)蛋白 ATG5、ATG12、LC3的表達(dá)，并用 RT-PCR分析 LC3 mRNA水平。與對(duì)照組相比， PCB29-pQ處理的細(xì)胞蛋白和基因的表達(dá)水平都顯著

4、增加，且在5μM PCB29-pQ處理24 h有最大值。而自噬降解底物 p62蛋白水平隨時(shí)間梯度降低，在5μM PCB29-pQ處理24 h表達(dá)水平最低。這些結(jié)果說(shuō)明PCB29-pQ能夠激活自噬體的形成階段，促進(jìn)自噬體降解底物的能力。第三階段通過(guò)加入CQ抑制LC3的降解后檢測(cè)LC3表達(dá)的凈通量，結(jié)果表明PCB29-pQ作用后提高了LC3凈通量并在5μM PCB29-pQ作用24 h時(shí)最明顯。并且通過(guò)轉(zhuǎn)染GFP-LC3質(zhì)粒，免疫熒光觀察了

5、自噬體標(biāo)記LC3與溶酶體標(biāo)記 LAMP2的共定位，結(jié)果表明促進(jìn)了自噬體與溶酶體融合的階段。接著闡明了自噬的發(fā)生在 PCB29-pQ誘導(dǎo)細(xì)胞毒性中的作用，在加入不同階段自噬抑制劑3-MA和CQ后，通過(guò)CCK8、流式細(xì)胞儀、細(xì)胞凋亡標(biāo)志蛋白 caspase3的檢測(cè)，表明抑制自噬促進(jìn)了 PCB29-pQ誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性的增加。最后用加入ROS清除劑NAC的方法考察PCB29-pQ引起自噬水平升高的原因，結(jié)果表明，PCB29-pQ誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬的

6、激活受ROS水平的調(diào)節(jié)。根據(jù)以上研究可知，PCB29-pQ可以誘導(dǎo)HepG2和MDA-MB-231細(xì)胞發(fā)生自噬，并受細(xì)胞內(nèi) ROS水平的調(diào)節(jié)。PCB29-pQ引起的自噬受mTOR/p70S6k和ATG5/ATG12/LC3信號(hào)通路的調(diào)控，且作為一種存活機(jī)制保護(hù)細(xì)胞。
　　第二部分：探討了多氯聯(lián)苯醌在低濃度誘導(dǎo)自噬，高濃度誘導(dǎo)凋亡時(shí)，鈣蛋白酶活性的作用對(duì)自噬向凋亡信號(hào)傳遞的影響。首先通過(guò)JC-1熒光探針檢測(cè) HepG2細(xì)胞線粒體膜電

7、位，免疫印跡法檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白caspase9/caspase3等表達(dá)，TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡，免疫熒光檢測(cè)自噬標(biāo)志蛋白LC3焦點(diǎn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，隨著 PCB29-pQ處理濃度的升高細(xì)胞凋亡水平逐漸增加，而在低濃度5μM PCB29-pQ處理后自噬LC3焦點(diǎn)最多，隨著濃度升高，自噬LC3焦點(diǎn)數(shù)目降低。隨后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)PCB29-pQ誘導(dǎo)的細(xì)胞鈣離子水平的變化，熒光分光光度計(jì)檢測(cè)鈣蛋白酶活性，結(jié)果表明，PCB29-pQ可以

8、誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞鈣離子水平以及鈣蛋白酶活性的升高，以及在加入鈣離子螯合劑BAPTA-AM后抑制了calpain蛋白表達(dá)，表明，calpain的表達(dá)依賴于Ca2+水平的調(diào)節(jié)。文獻(xiàn)報(bào)道Beclin1、ATG5可經(jīng)鈣蛋白酶切割形成Beclin1-c、tATG5易位至線粒體將自噬向凋亡信號(hào)傳遞，而在本研究中 PCB29-pQ沒(méi)有引起 Beclin1、ATG5切割易位至線粒體。
　　第三部分：探討了多氯聯(lián)苯醌誘導(dǎo)細(xì)胞自噬與細(xì)胞凋亡轉(zhuǎn)換的機(jī)

9、制，分析選取了對(duì)自噬和凋亡有雙重調(diào)節(jié)作用的 p53/HMGB1蛋白。Western Blot和免疫熒光實(shí)驗(yàn)表明了PCB29-pQ作用后誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞p53/HMGB1易位到細(xì)胞質(zhì)。免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)表明了5μM PCB29-pQ作用后促進(jìn)了 HepG2細(xì)胞p53/HMGB1在細(xì)胞核中的結(jié)合，15μM PCB29-pQ作用后促進(jìn)了 HepG2細(xì)胞p53/HMGB1在細(xì)胞質(zhì)中的結(jié)合。由于HMGB1/p53可以作為核轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控下游靶基因的表

10、達(dá)，影響細(xì)胞自噬與凋亡。我們干擾了 p53蛋白表達(dá)后檢測(cè)了 p53下游靶基因 DRAM、ULK1、Bax表達(dá)，同時(shí)干擾了 HMGB1蛋白表達(dá)后 Western Blot檢測(cè)了HMGB1的下游蛋白HSPB1表達(dá)，結(jié)果表明，在抑制了p53/HMGB1的作用后，抑制了該蛋白調(diào)控的靶基因的表達(dá)。針對(duì)上述檢測(cè)結(jié)果，我們進(jìn)一步研究p53/HMGB1誘導(dǎo)細(xì)胞自噬和細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制。干擾p53基因后提取了核質(zhì)蛋白，Western Blot表明p53

11、siRNA后促進(jìn)了PCB29-pQ誘導(dǎo)的HMGB1進(jìn)一步易位至細(xì)胞質(zhì)，細(xì)胞存活率實(shí)驗(yàn)表明了p53 siRNA抑制了PCB29-pQ誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，免疫熒光 LC3焦點(diǎn)實(shí)驗(yàn)表明 p53 siRNA促進(jìn)了 PCB29-pQ誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬，而在加入HMGB1抑制劑EP后，細(xì)胞凋亡增加，細(xì)胞自噬水平降低。這些結(jié)論表明，易位到細(xì)胞質(zhì)中的 HMGB1發(fā)揮著抑制凋亡、促進(jìn)自噬的作用。在干擾了HMGB1蛋白后相同的實(shí)驗(yàn)方法證明HMGB1 siRNA后促