血管緊張素Ⅱ?qū)ψ慵?xì)胞自噬的影響及機(jī)制研究.pdf

1、研究背景與目的:
　　足細(xì)胞(podocyte)作為一種終末高度分化細(xì)胞,是維持腎小球?yàn)V過(guò)屏障(glomerular filtration barrier,GFB)的最關(guān)鍵部分,對(duì)防止血漿白蛋白和大分子蛋白的濾過(guò)起重要作用。足細(xì)胞的損傷和丟失是導(dǎo)致腎臟疾病發(fā)展和腎功能衰竭的主要因素。
　　自噬(autophagy)是存在于酵母至人類等真核生物細(xì)胞中的一種高度保守的、維持細(xì)胞自身內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的重要胞內(nèi)降解機(jī)制,通過(guò)溶酶體蛋白降解

2、途徑清除受損的細(xì)胞器和細(xì)胞內(nèi)毒性物質(zhì),以“垃圾處理廠”及“廢品回收站”的方式為蛋白質(zhì)的合成和細(xì)胞器的更新提供原料,從而維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)及細(xì)胞的完整性。作為一種終末高度分化細(xì)胞,足細(xì)胞的存活主要依賴于自噬吞噬體有效的清除不需要和損傷的蛋白質(zhì)和細(xì)胞器,以維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定及細(xì)胞正常生命活動(dòng),但過(guò)度的自噬會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生“自噬性程序性死亡”。定位在前自噬體和自噬體膜表面的微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(microtubule-Associated Pro

3、tein1 Light Chain3,LC3)參與了自噬體的形成,是目前檢測(cè)自噬水平的特異性標(biāo)記物。LC3以LC3-I和LC3-II兩種形式存在于細(xì)胞中,發(fā)生自噬時(shí)以細(xì)胞溶質(zhì)形式存在的LC3-I經(jīng)包含Atg7和Atg3在內(nèi)的泛素樣修飾加工后,與自噬體膜表面的磷脂酰乙醇胺(phosphatidyl ethanolamine,PE)結(jié)合,LC3-I即轉(zhuǎn)化為分子量較小的LC3-II并結(jié)合在自噬體膜上。Beclin-1是一種與自噬相關(guān)的抑癌基因

4、,與酵母自噬基因Atg6同源,通過(guò)與III型磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol3-kinase class III,PI3KC3)結(jié)合形成PI3K復(fù)合物,從而調(diào)節(jié)自噬體的形成。
　　腎素-血管緊張素系統(tǒng)(renin-angiotensinsystem,RAS)在腎臟疾病的病理生理進(jìn)程中起重要作用,血管緊張素II(angiotensin II,Ang II)作為RAS系統(tǒng)的主要效應(yīng)分子,可通過(guò)與細(xì)胞上的血管緊

5、張素受體(angiotensin receptor, ATR)作用,引起細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的損傷,近年來(lái)發(fā)現(xiàn)其在腎臟的局部濃度比系統(tǒng)水平高出60~100倍,,說(shuō)明AngII對(duì)腎臟細(xì)胞的直接生物學(xué)效應(yīng)可能更為關(guān)鍵。
　　Rho激酶又稱為Rho相關(guān)卷曲螺旋形成蛋白激酶(rho-associated kinase,ROCKs),是 Rho家族小 G蛋白成員 RhoA下游最主要、最具特征性的信號(hào)分子,屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族成員。多種炎

6、癥介質(zhì)和細(xì)胞因子能激活Rho激酶信號(hào)通路,如轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(transforming growth factor-β, TGF-β)、血小板源性生長(zhǎng)因子(platelet derived growth factor,PDGE)、白介素1(interleukin-1,IL-1)、內(nèi)皮素1(endothelin-1, ET-1)等。研究證實(shí)Rho激酶信號(hào)途徑也可以通過(guò)AngII激活,但其具體機(jī)制仍然不清。Rho激酶途徑具有調(diào)節(jié)細(xì)胞收縮、遷移

7、、增生、凋亡等功能,在多種腎臟疾病的發(fā)病機(jī)制中起重要作用。法舒地爾(fasudil)作為 Rho激酶抑制劑,在腎臟損傷中的保護(hù)作用被廣泛的證實(shí),如能阻止 TGF-β1誘導(dǎo)小管上皮細(xì)胞分化成成纖維細(xì)胞,防止小管間質(zhì)發(fā)生纖維化;通過(guò)抑制Rho激酶信號(hào)途徑,降低炎癥因子和細(xì)胞因子的分泌,減輕氧化應(yīng)激和蛋白尿,及改善腎臟血流動(dòng)力學(xué)來(lái)延緩糖尿病腎病的進(jìn)展等。目前研究發(fā)現(xiàn),Rho激酶通路在調(diào)節(jié)自噬中起重要作用,Aditi等研究發(fā)現(xiàn)激活Rho激酶通路

8、,使Beclin-1 BH3結(jié)構(gòu)域發(fā)生磷酸化,導(dǎo)致Beclin-1-Bcl-2多聚蛋白復(fù)合體解離,而不影響UVRAG-Beclin-1復(fù)合體的相互作用和增加Beclin-1和Vps34的相互作用,從而引起自噬發(fā)生;Yunbo chen等研究發(fā)現(xiàn)Aβ活化物能上調(diào)ROCK表達(dá)而激活自噬。3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3-MA)是磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol3-kinase,PI3K)的特殊抑制

9、劑,通過(guò)抑制Beclin-1-PI3KC3復(fù)合物的形成,而抑制自噬活性。目前研究顯示 Rho激酶途徑活化與 PI3K/AKT通路的活化相關(guān)。結(jié)合 ROCKs抑制劑法舒地爾對(duì)慢性腎臟病的保護(hù)作用。本研究擬采用AngII體外刺激足細(xì)胞,觀察足細(xì)胞的自噬情況,并通過(guò)法舒地爾和3-MA干預(yù)此過(guò)程,初步探討Ang II誘導(dǎo)足細(xì)胞自噬的可能機(jī)制,為腎臟疾病的治療的提供新思路。
　　實(shí)驗(yàn)方法:
　　1.人永生化足細(xì)胞(AB8/13)的復(fù)蘇

10、及培養(yǎng),在33℃、5％CO2中增值,在37℃、5%CO2中分化成熟后實(shí)驗(yàn)。
　　2.體外采用不同濃度AngII(10-8~10-6mol/l)刺激足細(xì)胞24h及固定濃度刺激足細(xì)胞不同時(shí)間(0h、6h、12h、24h、36h)后,Western blot檢測(cè)足細(xì)胞LC3-II和Beclin-1蛋白的表達(dá)情況。
　　3.將足細(xì)胞(AB8/13)進(jìn)行細(xì)胞爬片,用PI3K抑制劑3-MA(5mM)和Rho激酶抑制劑法舒地爾(10-7m

11、ol/l)預(yù)處理30min,AngII刺激足細(xì)胞24h后以免疫熒光法檢測(cè)自噬標(biāo)志物L(fēng)C3的表達(dá)及分布情況。
　　4.不同法舒地爾濃度(10-8~10-6mol/l)預(yù)處理足細(xì)胞30min,AngII刺激足細(xì)胞24h后,Western blot檢測(cè)足細(xì)胞LC3-II和Beclin-1蛋白的表達(dá)情況。
　　結(jié)果:
　　1.不同濃度(10-8mol/l~10-6mol/l)AngII刺激足細(xì)胞24h后,Western blo

12、t檢測(cè)LC3-II的蛋白表達(dá),隨著劑量的增加,LC3-II的蛋白表達(dá)增加,在濃度為10-7mol/l時(shí)達(dá)到峰值。
　　2.固定濃度(10-7mol/l)AngII刺激足細(xì)胞不同時(shí)間(0h、6h、12h、24h、36h),Western blot檢測(cè)LC3-II的蛋白表達(dá),隨著時(shí)間的延長(zhǎng),LC3-II的蛋白表達(dá)增加,在24h達(dá)到峰值,后呈下降趨勢(shì)。
　　3.不同濃度(10-8mol/l~10-6mol/l)AngII刺激足細(xì)胞

13、24h后, Western blot檢測(cè)Beclin-1的蛋白表達(dá),隨著劑量的增加,Beclin-1的蛋白表達(dá)增加,在濃度為10-7mol/l時(shí)達(dá)到峰值。
　　4.固定濃度(10-7mol/l)AngII刺激足細(xì)胞不同時(shí)間(0h、6h、12h、24h、36h),Western blot檢測(cè) Beclin-1的蛋白表達(dá),隨著時(shí)間的延長(zhǎng),Beclin-1的蛋白表達(dá)增加,在24h達(dá)到峰值,后呈下降趨勢(shì)。
　　5.3-MA抑制Ang

14、II誘導(dǎo)的足細(xì)胞LC3的表達(dá),并抑制其向細(xì)胞核周圍聚集。
　　6.法舒地爾單獨(dú)不影響足細(xì)胞 LC3-II和 Beclin-1的蛋白表達(dá),但能降低 AngII引起的 LC3-II和 Beclin-1的表達(dá),并呈一定的濃度依賴,法舒地爾濃度為10-7mol/l時(shí)抑制作用最強(qiáng)。
　　7.免疫熒光檢測(cè)單獨(dú)法舒地爾不影響LC3的表達(dá),但能抑制AngII誘導(dǎo)的足細(xì)胞LC3的表達(dá)及向細(xì)胞核周圍聚集。
　　結(jié)論:
　　本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)