同種異體脫細(xì)胞基質(zhì)構(gòu)建組織工程化氣管的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：外傷、腫瘤及先天性疾病造成的氣管缺損在臨床上較為常見(jiàn)。在缺損較短時(shí)，可直接行端端吻合修復(fù)，而一旦環(huán)狀缺損超過(guò)5個(gè)環(huán)或3cm，端端吻合就明顯較為困難。此時(shí)，尋找氣管替代物進(jìn)行氣管重建是最為理想的治療手段。自19世紀(jì)末氣管外科發(fā)展以來(lái)，氣管重建替代物的研究主要集中在人工氣管、自體組織、同種異體氣管及組織工程化氣管上，其中組織工程化氣管因其在免疫排斥、材料來(lái)源等方面的優(yōu)勢(shì)逐漸成為氣管重建外科的研究熱點(diǎn)。組織工程化氣管即為將經(jīng)體外擴(kuò)增的種

2、子細(xì)胞接種在具有環(huán)樣結(jié)構(gòu)的支架材料上，通過(guò)細(xì)胞之間相互黏附、生長(zhǎng)繁殖、分泌細(xì)胞外基質(zhì)，形成一定形狀且具有一定功能的氣管環(huán)，原位移植從而達(dá)到修復(fù)缺損、重建功能的目的。本研究的目的是使用化學(xué)消化法脫除同種異體氣管環(huán)組織內(nèi)細(xì)胞成分，形成氣管組織脫細(xì)胞基質(zhì)。同時(shí)采用自體骨髓MSCs體外誘導(dǎo)向軟骨細(xì)胞分化作為種子細(xì)胞，與同種異體氣管脫細(xì)胞基質(zhì)共同培養(yǎng)，觀察誘導(dǎo)的MSCs在脫細(xì)胞基質(zhì)上的黏附、生長(zhǎng)和增殖情況，以期尋找到組織工程化氣管構(gòu)建理想的種子細(xì)

3、胞和生物支架材料。 方法： 1、取4月齡Beagle犬6只，行雙側(cè)脛骨結(jié)節(jié)平臺(tái)穿刺抽取骨髓14～16ml，以1.073g/ml密度Percoll分離液結(jié)合貼壁法分離純化骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesetlchymal stem cells，MSCs)，體外培養(yǎng)傳代。取第3代細(xì)胞在含15﹪FBS的L-DMEM培養(yǎng)基內(nèi)加入TGF-β1濃度為10ng/ml、IGF-I為10ng/ml，維生素C為37.5 μ g/ml，轉(zhuǎn)鐵蛋白6.2

4、5μg/ml進(jìn)行成軟骨細(xì)胞定向誘導(dǎo)，對(duì)照組未添加任何細(xì)胞因子。通過(guò)相差顯微鏡每日觀察細(xì)胞生長(zhǎng)和形態(tài)變化情況；MTT法監(jiān)測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)情況變化并繪制生長(zhǎng)曲線；阿爾新蘭法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液內(nèi)GAG含量變化；細(xì)胞單層爬片作甲苯胺藍(lán)、Masson三色染色和Ⅱ型膠原免疫組化等組織學(xué)方法觀察誘導(dǎo)細(xì)胞軟骨細(xì)胞基質(zhì)分泌和Ⅱ型膠原生成情況。觀察骨髓問(wèn)充質(zhì)干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化的情況。 2、另取4～6月齡當(dāng)?shù)亟】惦s種犬，處死后立即手術(shù)切取甲狀軟骨下第6～10環(huán)氣管段

5、，以無(wú)菌PBS沖洗后，順序浸入1﹪Triton X-100和DNAse、RNAse溶液內(nèi)振蕩消化。其中以1﹪Trixton消化時(shí)間長(zhǎng)短分為24小時(shí)組、48小時(shí)組、72小時(shí)組和120小時(shí)組。分別采用組織切片HE染色、掃描電鏡等方法觀察樣本脫細(xì)胞效果并比較。 3、收集誘導(dǎo)第7天骨髓MSCs，調(diào)整細(xì)胞濃度為3×10<'6>/ml，與經(jīng)處理的同種異體氣管脫細(xì)胞基質(zhì)體外復(fù)合培養(yǎng)，于第3、7、14天取復(fù)合物行電鏡觀察MSCs在脫細(xì)胞基質(zhì)表面

6、黏附生長(zhǎng)情況。取體外培養(yǎng)第7天復(fù)合物與單純脫細(xì)胞基質(zhì)及新鮮同種異體氣管環(huán)樣本分別埋植宿主犬皮下，分別于第14天和第30天取出埋植物行組織切片MSCs在脫細(xì)胞基質(zhì)內(nèi)的生長(zhǎng)情況，觀察軟骨基質(zhì)內(nèi)有無(wú)細(xì)胞成分生成。 結(jié)果： 1、倒置相差顯微鏡下觀察初接種時(shí)原代MSCs24小時(shí)開(kāi)始逐漸貼壁，72小時(shí)貼壁細(xì)胞明顯增多，5天左右形成分布均勻的細(xì)胞集落，7～8天集落逐漸增大，相鄰集落融合成片狀。10天左右原代細(xì)胞鋪展面積可達(dá)到80﹪以上

7、。傳代細(xì)胞融合速度明顯加快，細(xì)胞變大，MTT生長(zhǎng)曲線顯示P1代次細(xì)胞生長(zhǎng)能力最為旺盛，至P3代細(xì)胞生長(zhǎng)情況逐漸穩(wěn)定。 2、加入誘導(dǎo)因子后細(xì)胞逐漸變圓變大，增殖速度加快。MTT檢測(cè)顯示P3細(xì)胞誘導(dǎo)組生長(zhǎng)曲線較未誘導(dǎo)組明顯左移。誘導(dǎo)14天細(xì)胞培養(yǎng)液內(nèi)gAG含量(42.48±2.32)μg/ml較同代次未誘導(dǎo)組(19.62±1.30)μg/ml升高(p<0.01)。誘導(dǎo)第14天細(xì)胞甲苯胺藍(lán)染色見(jiàn)胞漿內(nèi)廣泛藍(lán)染，Masson三色染色見(jiàn)胞

8、漿綠染，Ⅱ型膠原免疫組化染色見(jiàn)胞漿內(nèi)黃色或棕黃色顆粒出現(xiàn)，而未誘導(dǎo)組陽(yáng)性細(xì)胞不明顯。 3、使用1﹪Triton X-100溶液與酶聯(lián)合消化法制備犬同種異體氣管脫細(xì)胞基質(zhì)至少需要作用120小時(shí)，方可完全脫除氣管黏膜及軟骨部分全部細(xì)胞成分。HE染色顯示120小時(shí)組氣管樣本細(xì)胞成分完全脫失，黏膜脫細(xì)胞基質(zhì)局部與軟骨基質(zhì)分離，軟骨基質(zhì)完整無(wú)明顯破壞；掃描電鏡顯示氣管脫細(xì)胞基質(zhì)黏膜細(xì)胞及軟骨細(xì)胞脫除徹底，去除黏膜部分可見(jiàn)軟骨基質(zhì)表面軟骨陷

9、窩結(jié)構(gòu)清晰，陷窩內(nèi)無(wú)細(xì)胞結(jié)構(gòu)。 4、誘導(dǎo)MSCs與異體氣管脫細(xì)胞基質(zhì)體外聯(lián)合培養(yǎng)3天電鏡下即可見(jiàn)細(xì)胞定植于基質(zhì)表面，有偽足伸出。7天時(shí)可見(jiàn)數(shù)層細(xì)胞生長(zhǎng)于基質(zhì)表面，細(xì)胞之間互相連接成片狀，并有大量細(xì)胞外基質(zhì)分泌，呈“冰霜”樣改變。14天時(shí)可見(jiàn)基質(zhì)表面細(xì)胞出現(xiàn)凋亡，部分細(xì)胞呈空泡樣改變。復(fù)合物宿主犬皮下埋植14天HE染色基質(zhì)表面可見(jiàn)多層細(xì)胞，細(xì)胞呈扁長(zhǎng)形，胞核較大。軟骨脫細(xì)胞基質(zhì)內(nèi)部未見(jiàn)細(xì)胞長(zhǎng)入。周圍有肉芽組織包裹，可見(jiàn)少量淋巴細(xì)胞

10、浸潤(rùn)。30天時(shí)軟骨基質(zhì)淺層可見(jiàn)少量細(xì)胞成分長(zhǎng)入，但無(wú)明顯新生軟骨形成。大部分軟骨膠原基質(zhì)被破壞分解，可見(jiàn)較多淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。 結(jié)論： 1、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞是軟骨組織工程理想的種子細(xì)胞。取材方便，Percoll分離液分離結(jié)合貼壁純化可以獲取大量骨髓問(wèn)充質(zhì)干細(xì)胞，體外培養(yǎng)性能穩(wěn)定，易于傳代擴(kuò)增，在一定誘導(dǎo)條件的培養(yǎng)下，可以分化為軟骨細(xì)胞。 2、去污劑-核酸酶聯(lián)合消化法使用1﹪Triton X-100可有效去除氣管樣本全