番茄中與病害密切相關miRNA的功能分析.pdf

1、MicroRNA(miRNA)是一類在生物體內普遍存在的長度約22nt的內源性非編碼小分子RNA。近年的研究表明，miRNA在植物與病原物互作過程中起著重要的調節(jié)作用。當病原物侵染番茄時，常造成嚴重的病害，給番茄的生產帶來較大的經濟損失。雖然，目前關于番茄中與病害相關miRNA已有研究，但是，關于番茄中與病害密切相關miRNA的研究還不系統?；谏鲜鰻顩r，本研究利用生物信息學方法，挖掘到番茄中與病害密切相關的miRNA，并通過生物學實驗

2、方法探究了關鍵miRNA的功能。
　　首先，本研究通過搜集文獻和miRBase數據庫，找到了番茄中34個miRNA的表達與病害相關，采用生物信息學方法預測它們的靶基因，利用Cytoscape軟件構建miRNA間的調控網絡，從中篩選出13個與病害密切相關的miRNA。根據各miRNA之間關聯性的大小及其與病害相關靶基因的多少，又進一步選出miR169、miR482、miR5300、miR6024、miR6026和miR6027共6個

3、關鍵miRNA，并對其進行了靶基因功能分析、啟動子分析及實時定量PCR驗證，為全面深入研究miRNA的作用機制奠定了基礎。
　　其次，挑出最為關鍵的miR482b和miR6024作為本文的重點研究對象，采用實時定量PCR技術分析了二者的組織特異性，以及在病原菌和SA脅迫下兩個miRNA與其靶基因的表達模式。結果發(fā)現，兩個miRNA在葉中的表達量均高于根和莖中的，且均能對上述脅迫做出響應，并與各自靶基因呈負相關。暗示這兩個miRNA

4、可能通過調控靶基因的表達進而參與番茄對逆境的脅迫響應過程。
　　最后，為了進一步探究miR482b和miR6024的功能及作用機制，本文分別克隆了番茄中的MIR482b和MIR6024基因，成功構建了相應的過表達載體及瞬時轉化體系，并獲得了轉基因番茄植株。經檢測發(fā)現，轉基因番茄中miR482b的表達量上調，其相應靶基因的表達量出現不同程度的下調，且提高了病原菌對番茄的致病能力。多項結果表明miR482b和miR6024可能在番茄響