番茄中與病害密切相關(guān)miRNA的功能分析.pdf

1、MicroRNA(miRNA)是一類(lèi)在生物體內(nèi)普遍存在的長(zhǎng)度約22nt的內(nèi)源性非編碼小分子RNA。近年的研究表明，miRNA在植物與病原物互作過(guò)程中起著重要的調(diào)節(jié)作用。當(dāng)病原物侵染番茄時(shí)，常造成嚴(yán)重的病害，給番茄的生產(chǎn)帶來(lái)較大的經(jīng)濟(jì)損失。雖然，目前關(guān)于番茄中與病害相關(guān)miRNA已有研究，但是，關(guān)于番茄中與病害密切相關(guān)miRNA的研究還不系統(tǒng)?；谏鲜鰻顩r，本研究利用生物信息學(xué)方法，挖掘到番茄中與病害密切相關(guān)的miRNA，并通過(guò)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)

2、方法探究了關(guān)鍵miRNA的功能。
　　首先，本研究通過(guò)搜集文獻(xiàn)和miRBase數(shù)據(jù)庫(kù)，找到了番茄中34個(gè)miRNA的表達(dá)與病害相關(guān)，采用生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)它們的靶基因，利用Cytoscape軟件構(gòu)建miRNA間的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，從中篩選出13個(gè)與病害密切相關(guān)的miRNA。根據(jù)各miRNA之間關(guān)聯(lián)性的大小及其與病害相關(guān)靶基因的多少，又進(jìn)一步選出miR169、miR482、miR5300、miR6024、miR6026和miR6027共6個(gè)

3、關(guān)鍵miRNA，并對(duì)其進(jìn)行了靶基因功能分析、啟動(dòng)子分析及實(shí)時(shí)定量PCR驗(yàn)證，為全面深入研究miRNA的作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。
　　其次，挑出最為關(guān)鍵的miR482b和miR6024作為本文的重點(diǎn)研究對(duì)象，采用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)分析了二者的組織特異性，以及在病原菌和SA脅迫下兩個(gè)miRNA與其靶基因的表達(dá)模式。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兩個(gè)miRNA在葉中的表達(dá)量均高于根和莖中的，且均能對(duì)上述脅迫做出響應(yīng)，并與各自靶基因呈負(fù)相關(guān)。暗示這兩個(gè)miRNA

4、可能通過(guò)調(diào)控靶基因的表達(dá)進(jìn)而參與番茄對(duì)逆境的脅迫響應(yīng)過(guò)程。
　　最后，為了進(jìn)一步探究miR482b和miR6024的功能及作用機(jī)制，本文分別克隆了番茄中的MIR482b和MIR6024基因，成功構(gòu)建了相應(yīng)的過(guò)表達(dá)載體及瞬時(shí)轉(zhuǎn)化體系，并獲得了轉(zhuǎn)基因番茄植株。經(jīng)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因番茄中miR482b的表達(dá)量上調(diào)，其相應(yīng)靶基因的表達(dá)量出現(xiàn)不同程度的下調(diào)，且提高了病原菌對(duì)番茄的致病能力。多項(xiàng)結(jié)果表明miR482b和miR6024可能在番茄響